厌氧消化灭活畜禽粪污中病原菌的研究进展

任丽娟, 林 敏, 董仁杰, 乔 玮

(1.中国农业大学 工学院， 北京 100083； 2.国家能源生物燃气高效制备及综合利用技术研发实验中心(中国农业大学)， 北京 100083)

我国每年产生约38亿吨畜禽粪污[1]，如果处置不当会成为重要的环境污染源。厌氧消化可以产生沼气和沼肥，是畜禽粪污的主要处理方式。但是，畜禽粪污中含有大量病原菌(如：大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌等)，种类多、生理特性复杂，如果不经有效杀灭就进入环境，会对生态和人群健康造成危害[2]。有研究报道，在厌氧消化的沼液沼渣土地利用周围，有居民患皮疹、红眼病、嗓子痛和肺病等疾病[3]。在厌氧消化过程中高效杀灭病原菌对畜禽粪污的处理非常重要。厌氧消化过程中的多种因素，如发酵底物浓度、挥发性脂肪酸(Volatile fatty acids, VFAs)和发酵温度等均对病原菌的灭活起到非常重要的作用。同时，细菌在特定环境中还具有进入活的但不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)的特征，通过常规最大或然数法(Most probable number, MPN)不能将其检出，增加了病原菌的环境控制风险[4]。为此，本文分析了国内外厌氧消化有关病原菌灭活影响因素的文献，从病原菌控制的角度为研发厌氧消化工艺提供新的思路。

1 病原菌的常见种类、危害、致病途径及控制标准

1.1 常见种类及危害

常见的病原微生物包括细菌、病毒、原生动物和蠕虫卵，其中病原菌主要有大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌和肠球菌等。这些病原菌的生理特性、结构特点以及含量在不同的畜禽粪污中均有所不同。已报道的常见病原菌及其危害如表1所示。其中，沙门氏菌常见于牛粪和猪粪中，含量分别为106CFU·g-1以上和106～107CFU·g-1，能够引起伤寒、急性肠胃炎和急性败血症等疾病。大肠杆菌在牛粪、羊粪、鸡粪和猪粪中均能被检测到，在牛粪中含量较高，达107～108CFU·g-1，可致人患重症水泻、脱水等。牛粪和羊粪中的弯曲杆菌，会随废水排放而污染水源，是许多工业化国家人群急性腹泻、腹痛的主要致病菌[5]。分布于猪粪中的肠球菌被检测到含量约为105～106CFU·g-1，能够通过粪口传播进入人体肠道，导致腹泻、腹痛等症状。

表1 几种常见病原菌及其危害

1.2 致病途径

病原菌与人群接触，并致人患病的途径主要有以下几个方面。1)消化道：人类被感染致病，多数是因为畜禽粪污污染了地表水或地下水，人在饮用被污染的水之后引起的[15]。厌氧消化后的沼液沼渣如处理或处置不当，便会污染地表水、地下水和土壤。人群通过手和衣服等接触病原菌后，将病原菌带入食物链，饮用受到污染的水和食用种植在被污染土壤上的粮食作物后而患病[16]。2006年7月，深圳罗湖区某小区爆发了一起由产毒性大肠杆菌(ETEC)引起的群体性腹泻。该小区二次供水系统受到污染，居民不良的个人卫生习惯是导致疾病爆发的主要原因[17]； 2)呼吸道：在土地耕作、收获作物和刮大风时，施加到土壤表层的沼液沼渣中的病原菌会通过空气弥散，与水、尘埃等凝结成微小颗粒悬浮在空气中，形成微生物气溶胶或粉尘，可引起人类患病[18]； 3)皮肤创口：当人们通过手或者衣服直接或间接接触到病原菌时，其会经过皮肤伤口包括烫伤、划伤以及手术伤等侵入人体使人患病，如金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌等[19]。

1.3 病原菌控制标准

不同种类的病原菌，由于其毒性、生长和繁殖条件不同，能够致人患病的数量也不同。如伤寒沙门氏菌致人患病的数量是108～109个·人-1，痢疾志贺氏菌是7个·人-1[19]。为了保证病原菌含量低于可致人患病范围，国内外制定了相应的控制标准，如表2和表3所示。在英国、欧盟和爱尔兰，要求大肠杆菌的菌落形成单位(CFU)在每克新鲜物质中要少于103个，沙门氏菌不得在50 g，25 g，25 g新鲜物质中检出。美国和法国则要求沙门氏菌的最大或然数(MPN)分别为4 g总固体中少于3个，10 g总固体中少于8个。美国环保署“503”法案中AB两级标准对粪大肠菌群的数量要求分别少于103MPN·g-1TS，2×106MPN·g-1TS。我国《畜禽养殖业污染物排放标准》(GB18596—2001)中要求处理后畜禽粪便中的粪大肠菌群少于105个·kg-1；《畜禽粪便无害化处理技术规范》(GB36195—2018)中规定常温沼气发酵和高温沼气发酵处理后粪大肠菌群的数量分别少于105个·L-1，102个·L-1；《粪便无害化卫生要求》(GB7959—2012)对不同消化工艺污泥中含有的粪大肠菌群数量要求不同，中常温、高温、兼性厌氧发酵分别少于104个·L-1，102个·L-1，104个·L-1；我国《农用污泥污染物控制标准》(GB4284—2018)要求粪大肠菌群的数量少于105个·L-1；《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918—2002)中的一级标准分为AB两级，对粪大肠菌群的要求分别少于103个·L-1，104个·L-1，二级标准要求少于104个·L-1。美国和法国要求肠道病毒的菌落形成个数(PFU)在4 g总固体和10 g总固体中分别少于1个和3个。美国对活性蠕虫卵的要求是少于1个活卵·4 g-1TS，欧盟要求其死亡率要多于3log10，法国则要求少于3个活卵·10 g-1TS。我国《畜禽养殖业污染物排放标准》(GB18596—2001)、《畜禽粪便无害化处理技术规范》(GB36195—2018)和《农用污泥污染物控制标准》(GB4284—2018)均要求蠕虫卵的死亡率超过95%。《粪便无害化卫生要求》(GB7959—2012)对常温、中温厌氧消化要求蠕虫卵的沉降率超过95%，高温厌消化要求蠕虫卵的死亡率超过95%。此外，我国的《畜禽粪便无害化处理技术规范》(GB36195—2018)和《粪便无害化卫生要求》(GB7959—2012)中对血吸虫和钩虫的要求是不得检出活卵。从表2可以看出，欧美等发达国家从20世纪90年代就开始关注病原菌的问题并制定了相应的控制标准，而由表3可知 ,我国关注得则较晚,且对于病原菌种类来说，我国目前的各种控制标准并没有国外全面。

表2 病原微生物的控制标准

表3 我国病原微生物的控制标准

2 厌氧消化灭活病原菌的影响因素

2.1 发酵底物浓度

底物浓度是导致肠道细菌在中温厌氧消化过程中灭活的主要因素之一。有研究发现，在猪粪和餐厨垃圾混合干式中温(37℃)厌氧共消化系统中，将进料总固体(Total Solid, TS)稀释至20%，沙门氏菌的灭活时间将从湿式厌氧消化的几个月缩短至6～7天[30]。在进行剩余污泥高温厌氧消化时发现，进料剩余污泥的TS在28～45 g·L-1时，大肠杆菌的杀灭数量随着底物浓度的增加而增加；当TS为45 g·L-1时，总大肠杆菌的灭活效果达到99.89%；当TS超过45 g·L-1时，虽然灭活率总能保持在98%以上，但是却出现浓度过高灭活效果反而缓慢下降的趋势[31]。对餐厨垃圾和猪粪混合中温(37℃)厌氧共发酵，进料TS为20%，大肠杆菌的数量4天内迅速从6.2×108CFU·g-1下降到最低检测限(100 CFU·g-1)以下[32]。干式厌氧消化中的高底物浓度可能会导致较高浓度的VFAs，虽然能够提高病原菌的灭活效果，但是较高浓度的VFAs容易积累，使产甲烷过程受到抑制，严重干扰厌氧工程平稳运行。因此，关于底物浓度对厌氧消化过程中病原菌的灭活效果还需同时考虑较高底物浓度带来的负面影响。

2.2 pH值和挥发性脂肪酸

pH值是厌氧消化过程中杀灭病原菌的一个重要影响因素。有研究指出，对猪粪进行中温厌氧消化24 h，鼠伤寒沙门氏菌可以在pH值为6.8的条件下存活，但是却不能在pH值为4.0的条件下存活[33]。此外，挥发性脂肪酸(Volatile fatty acids, VFAs)作为厌氧消化产甲烷过程的中间产物，对病原菌的灭活也起到了重要的作用。挥发性脂肪酸进入病原菌细胞并产生破坏性作用的原理如图1所示。在较低的pH值条件下，VFAs多以分子态存在[34]。游离VFAs具有亲脂性，可以穿过细菌细胞膜在细胞中解离，产生的氢离子使细菌细胞内部pH值下降，对病原菌更具破坏性[35]。细胞内酸碱度的降低最终会降低质子的动力，导致三磷酸腺苷(ATP)的产生速度变慢，从而限制了细胞的生长，抑制病原菌致病基因的表达[36]。此外，进入细胞的酸根离子可以抑制细菌细胞内DNA和蛋白质的合成过程，破坏细菌的繁殖进程[37]。VFAs浓度越高，病原菌的灭活效率就越高[38]。在对猪粪和餐厨垃圾中温厌氧共消化时发现游离VFAs是总大肠菌群和大肠杆菌灭活的重要因素，1 mg·L-1的VFAs可使总大肠菌群和大肠杆菌的数量分别减少0.184和0.174 log10CFU·g-1[30]。对城市废水污泥进行中温(35℃)厌氧消化，当VFAs浓度大于6000 mg·L-1时，沙门氏菌经过24 h后由110 CFU·mL-1下降至30 CFU·mL-1；当VFAs浓度为750 mg·L-1时，沙门氏菌仅降至90 CFU·mL-1[39]。另外，有研究表明，关于pH值和VFAs对病原菌的灭活效果之间存在相互促进作用。对牛粪中温厌氧消化时，在VFAs为5000 mg·L-1，pH值为6.0的条件下，伤寒沙门氏菌数量迅速下降，12天内可完全消除，而在VFAs为100 mg·L-1，pH值为6.8下则需要26天[40]。对污泥进行中温(37℃)厌氧消化的过程中，如果系统的初始pH值在5.5以下，当VFAs处于较高浓度范围5000～7000 mg·L-1时，两天内沙门氏菌便可以被灭活；而当pH值处于中性或者碱性条件时，即使VFAs浓度高达9000 mg·L-1，对病原菌的灭活作用也不明显[41]。高浓度VFAs和较低的pH对于病原菌的灭活具有协同作用，需要同时考虑这两种因素对病原菌的灭活机理。

常见挥发性脂肪酸在水溶液中的解离常数如表4所示。甲酸、乙酸、丙酸、丁酸在pH值为0～7的条件下，分子态酸和离子态酸的比例如图2。从图2可以看出，随着pH值的升高，离子态酸比例在上升，分子态酸比例在下降。由于分子态酸对病原菌更具破坏性，所以高pH值条件下对病原菌的灭活效果也可能会降低。

表4 常见挥发性脂肪酸在水溶液中的解离常数(25℃)

2.3 发酵温度

厌氧消化一般可分为高温厌氧消化(50℃～55℃)和中温厌氧消化(30℃～42℃)。发酵温度是病原菌灭活的重要影响因素之一。高温能够直接影响病原菌的细胞膜组成，比中温杀菌效果好[42]。细胞膜的磷脂双分子层中镶嵌着许多有运输功能的蛋白质(占比50%～70%)，控制细胞内外营养物质和代谢废物的运送；此外，细胞膜上还存在与氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢有关的酶，可使细胞膜内外形成电位差，为细胞产能[19]。在较高的温度条件下，细胞膜上的蛋白质变性、酶失活，影响病原菌的生长代谢和繁殖，最终导致其死亡。对于中温厌氧消化来说，其温度是许多病原菌和病毒(肠道病毒)的适宜生长温度，对病原菌的灭活效果较高温差[10]。牛粪在35℃条件下厌氧消化5天后，大肠杆菌的去除率可达到99.6%，而在室温下相同的时间只能达到6.86%[43]。对奶牛粪进行批次厌氧消化时，35℃下鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量减少90%所需时间分别为2.4天、0.9天和1.8天，而在53℃条件下，以上3种病原菌的数量减少90%所需时间则为0.7小时、0.4小时和0.4小时[44]。在对猪粪进行厌氧消化时(4℃～52℃)，大肠杆菌在4℃的猪粪中最多可存活24天，在较高的温度下仅能存活7天(15℃)或6天(22℃)，而在42℃和52℃下存活时间只有几小时[45]。在牛粪批次厌氧消化实验中，温度为低温(25℃)、中温(37℃)和嗜热(52.5℃)时，大肠杆菌的去除量达到90%所需的时间分别为9～10天，7～8天和少于1天；在52.5℃时灭活率分别是25℃和37℃的17倍和15倍[46]。美国环保署指出，正常运行的两相厌氧消化工艺和高温厌氧消化工艺的出泥均能达到A类污泥排放标准(见表2)，而中温厌氧消化工艺的出泥则是B类(见表2)[47]。虽然从病原菌控制的角度考虑，高温发酵工艺是更好的选择。但是，目前工程中较多采用的仍是中常温发酵工艺。主要是由于高温厌氧消化工艺能耗较高，投入更大，工艺稳定性差，使其应用受到一定限制。有数据显示，德国90%的沼气工程采用中温发酵，大约9%的沼气工程采用高温发酵。中国普遍采用常温发酵[48]。

2.4 停留时间的影响

一般来说，停留时间越长对病原菌的灭活效果越好。在猪粪和餐厨垃圾中温(35℃～37℃)厌氧共消化系统中，平均停留时间为20天时，金黄色葡萄球菌SA11的细胞数量从8.69 logCFU·mL-1下降到2.77 logCFU·mL-1，且停留时间每增加一天，肠球菌的数量减少0.126 logCFU·mL-1；据推测，随着物料在消化池中停留时间的延长，也可能会导致金黄色葡萄球菌SA11细胞的完全失活[49]。在污泥中温厌氧消化中，大肠杆菌可在40～60天内降至103CFU·g-1以下(减少了3.6～6 log10)，而停留时间为20天时仅实现了1～2 log10的减少量[10]。停留时间和温度之间还存在协同作用。对猪粪和餐厨垃圾进行中温厌氧共消化时，6～7天才能完全消除沙门氏菌[30]。而在高温条件下，对污水污泥进行厌氧消化时，沙门氏菌只需在20～60分钟就能被完全消除[50]。也有研究指出延长停留时间对某些病原菌并没有明显的影响。对猪粪进行中温(39℃)厌氧消化，将停留时间由21天增加至41天后，大肠杆菌的去除量稍微增加但是并不明显，浓度基本都处在2.0～2.5 logCFU·g-1之间[51]。由此可见，停留时间不是影响病原菌去除效果的单一因素，而可能和其他因素有关，是影响病原菌灭活效率的间接因素。

2.5 氨氮的影响

在厌氧消化过程中，随着蛋白质等有机含氮物质降解转换为氨氮，系统中氨氮浓度有所升高，对产甲烷过程产生一定抑制。但是，研究发现氨氮对病原菌的灭活具有积极作用[52]。游离氨(NH3)具有亲脂性，可以通过细菌细胞膜到达细胞内进行解离，使pH值升高，对病原菌有毒害作用。不同pH值下分子态和离子态氨氮的比例如图3所示。从图3可以看出，随着pH值增加，离子态氨氮所占比例在下降，分子态氨氮所占比例在上升。由于分子态氨氮对病原菌更具有破坏性，所以病原菌的灭活率也可能逐渐上升。对猪粪进行中温(39℃±1℃)厌氧消化，发现大肠杆菌、产气荚膜梭菌和肠杆菌等含量与分子氨(NH3)含量之间存在显著的负相关关系，表明分子态氨氮能促进病原菌的杀灭效果[53]。污泥37℃中温厌氧消化时，在高氨氮水平下(6.9 g·L-1)，沙门氏菌和肠球菌减少5个对数所需的时间相较氨氮含量为0.9 g·L-1的16天和19天分别从减少到1.6天和4.2天[54]。一般来说，氨氮浓度越高，杀菌效果越好。但是，厌氧消化系统中氨氮浓度过高会抑制产甲烷菌的活性[55]。有研究表明，当有机负荷率和水力停留时间设置合理时，厌氧消化产甲烷系统也可以在很高的氨氮浓度下(6000 mg·L-1)正常运行，打破了以往对氨氮含量抑制厌氧消化的判断[56]。由此可见，对含氮量高的原料进行厌氧处理时，存在氨氮促进病原菌灭活的积极作用，但同时也要考虑过高氨氮对发酵可能造成的不利影响。

2.6 病原菌生理抗性的影响

不同的病原微生物对厌氧消化环境具有不同的抗性，依次为：可以形成芽孢的革兰阳性菌>不能形成芽孢的革兰阳性菌>线虫≥革兰氏阴性菌≥病毒[42]。革兰氏阳性菌细胞壁中厚厚的多层肽聚糖和磷壁酸可以作为渗透性屏障，防止有毒因子进入细胞；而革兰氏阴性菌的细胞壁则薄得多，仅包含单层的肽聚糖和富含脂质的外膜，几乎不能作为渗透性屏障提供保护，游离态VFAs更容易穿过其细胞膜[57]。这可能是导致在相同条件下革兰氏阴性菌(大肠杆菌等)比革兰氏阳性菌(肠球菌等)更容易失活的原因。有研究指出，将细菌和寄生虫卵保存在温度为55℃的粪肥(牛粪、猪粪)滤袋中，在消化池中放置24 h后，没有发现有活力的沙门氏菌(革兰氏阴性菌)或猪蛔虫卵[58]。而在温度为55℃的连续搅拌反应器中，却无法完全杀灭牛粪中的隐孢子虫，达不到控制标准[6]。对牛粪进行中温(35℃)厌氧消化时发现，大肠杆菌和伤寒沙门氏菌能够存活10天；痢疾杆菌只能存活5天；粪链球菌的存活时间最长，可存活15天[43]。病毒的核糖核酸(RNA)和蛋白质衣壳是其主要的抗性机制，但其抗性相较前几种病原微生物较弱。有研究表明，在4℃下对初沉池的污泥持续厌氧消化10天，脊髓灰质炎病毒的致病性可下降99%，经检测发现其RNA基因组被切割，蛋白质衣壳裂解[59]。不同种类的病原菌体现出不同的抗性，这与其自身的细胞结构有直接联系。

2.7 生态位的影响

生态位是指一个种群在生态系统中，在时空上所占据的位置及与其相关生物种群之间的功能关系与作用。温度，VFAs，氨氮等都是生态位时空的一部分。每个物种只有一个生态位且不能重叠，若有重叠，必然会通过物种间的竞争减少重叠，以达到系统稳定。研究发现，厌氧消化过程中一些常见厌氧菌的生长能够抑制沙门氏菌的生长。通过向污泥中温厌氧消化池中加入沙门氏菌，发现沙门氏菌并没有生长，50 h内沙门氏菌的死亡率达到了99%[60]。表明厌氧菌群可能会产生某种酶或者抑制产物，最终导致沙门氏菌的死亡。不同厌氧工艺的消化污泥在室温下放置20 t后，病原菌数量均下降了2～3个数量级[61]。这可能是在室温储存过程中，厌氧菌与病原菌竞争代谢基质，导致病原菌由于营养物质不足而逐渐死亡。

关于厌氧消化过程中常见病原菌和厌氧菌的生理特性如表5所示。从表5可以看出，大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的最适生长温度都处于30℃～37℃之间，厌氧菌在中温和高温各有1个适宜生长的温度范围，能够适应的温度范围较前几种病原菌宽。另外，这几种病原菌适宜生存的pH值都处于6.0～8.0，而发酵细菌和产氢产乙酸菌能在pH值(5.0～6.0)较低的环境中生存，产甲烷菌能够在pH值6.8～7.2条件下生存，耗氢产乙酸菌能够适应的pH值范围则更大，为5.0～8.3。对于厌氧消化中的水解阶段来说，适应较酸环境的发酵细菌和产氢产乙酸菌能够生长较好而上述几种病原菌却可能因环境pH值较低而被灭活。此外，上述几种病原菌均能利用葡萄糖进行繁殖代谢，而厌氧菌中的耗氢产乙酸菌也能够利用葡萄糖，其对葡萄糖的底物竞争也可能是导致厌氧消化过程中病原菌灭活的原因。另外，大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌均为革兰氏阴性菌，厌氧菌中既有革兰氏阴性菌也有革兰氏阳性菌，比病原菌能更好地适应厌氧环境，而厌氧菌生长繁殖越旺盛，对病原菌的抑制作用越强。这也从一定程度上解释了为什么厌氧消化系统能起到灭活病原菌的作用，但是厌氧菌却能在其中很好地生存。关于厌氧消化过程中其他厌氧微生物对于病原菌抑制作用的确定分析较少，其机理仍需进一步探究。

表5 常见病原菌和厌氧菌的生理特性比较

3 细菌存在VBNC状态的影响

3.1 VBNC状态

某些细菌为了抵抗不良环境继续存活，会进入活的但不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)[72]。处于VBNC状态的细菌不能在常规微生物培养基上培养，通常不会引发疾病，但并不代表它们不具有毒性。它们仍保留毒力，并且在复苏到活跃代谢状态后仍可以致人患病[73]。通过MPN和q-PCR方法对牛粪中大肠杆菌的数量进行检测，结果发现，与MPN相比q-PCR方法的结果高出100倍，这种差异表明大多数的大肠杆菌是不可培养的[9]。污泥在高温55℃，固体停留时间(Solid retention time, SRT)15～20天条件下进行厌氧消化，进水中大肠杆菌浓度约为107CFU·g-1，通过传统培养法测量出水中大肠杆菌的浓度为2×101CFU·g-1，而通过c-PCR技术测得大肠杆菌的浓度为7×105CFU·g-1，两者相差四个数量级，也说明了有VBNC状态的病原菌存在[74]。

3.2 诱导细菌进入VBNC状态的因素

迄今为止，已经陆续发现80余种细菌能够在不利环境条件下进入VBNC状态。包括大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、结核杆菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等。据报道，诱导细菌进入VBNC状态的因素有很多，主要包括温度、营养物质、pH值、盐度、氧含量和光照等[4]。处于VBNC状态下的细菌仍然是活的，能够保持细胞完整性，且能够维持正常生理活动，包括呼吸作用、基因转录及蛋白质合成等[75]。尽管它们的代谢水平较低，细胞形态、细胞壁的组成会发生一系列改变，但复苏后仍可以进行培养。因此，细菌存在VBNC状态的影响是评估厌氧消化过程中病原菌杀灭效果好坏的一个重要因素。

4 结论

厌氧消化能够灭活畜禽粪污中的病原菌，但是不同的工艺条件、不同的原料，对病原菌的灭活效率有很大差异。厌氧消化中对病原菌的灭活是一个复杂的控制过程，关于病原菌灭活的影响因素有很多。这些因素之间相互影响，共同决定了病原菌的灭活效果，其灭活机理仍需要进一步探索和明确。厌氧消化中间代谢产物对灭活病原菌效果有促进作用，但同时也可能会对厌氧消化系统产生不利影响。因此，要合理选择和调控厌氧消化工艺条件，实现高效发酵与病原菌去除的双重目标。此外，以往认为被灭活的病原菌，有可能是进入了VBNC状态，而并未被真正杀死，加大了后续控制病原菌的难度。因此，需要进一步探究病原菌的真实灭活效果，改进厌氧消化工艺。