分泌型烟草腺毛形态和叶面化学成分的比较

马旭东，王召军，闫筱筱，崔 红，张洪映

河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002

植物表皮毛是表皮细胞的特化结构，是植物表皮细胞的延伸，广泛存在于植物的地上部分。植物表皮毛作为植物与环境间的天然屏障，能有效减轻病原菌、昆虫等有害生物对植物的损害以及紫外线照射造成的损伤，有利于减少水分散失和热量损耗，提高植物对自身温度的调节能力［1-3］。拟南芥的表皮毛是一种特化的、无腺体的单细胞表皮毛［4-5］。与拟南芥不同的茄科、豆科、菊科、大麻科和唇形科等植物属于多细胞表皮毛，这些物种的表皮毛类型丰富，根据其分泌腺的有无，可分为保护毛（非分泌型）和腺毛（分泌型）。如菊科蒿属的黄花蒿表面有两种表皮毛，包括腺毛和T型保护毛。青蒿素是黄花蒿在腺毛中合成、积累和分泌的一种倍半萜内酯，以青蒿素为基础的联合用药（ACTs）被认为是治疗疟疾的一线药物［6］。番茄属植物表皮毛共有7种类型（Ⅰ～Ⅶ），其中Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ型属于腺毛，Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型为保护毛［7-8］。茄科烟草属植物的表皮毛发达，包括保护毛和腺毛，腺毛约占总表皮毛的85%，根据腺毛柄部长度，又分为长柄腺毛和短柄腺毛；烟草腺毛分泌物中不仅含有西柏烷二萜等重要的香气前体物质，还具有抵抗蚜虫的作用［9］。有研究表明，烟草分泌物西柏三烯二醇有抗癌作用，且可诱导爱泼斯坦-巴尔病毒早期抗原和蛋白质磷酸化［10］。烟草长柄腺毛中可产生含Cd/Ca的晶体并外溢，进而主动排除烟叶中的Cd［11-12］。短柄腺毛是叶面抗性蛋白的主要合成场所，在抑制孢子萌发、抵抗真菌侵染中具有重要作用［13］。而目前有关不同类型烟草腺毛分泌物的差异方面鲜见报道，为此，以不同腺毛类型的烟草品系TI1068和TI35为材料，分析其表皮毛的形态结构、主要叶面化学成分以及蚜虫嗜好性，旨在揭示烟草腺毛分泌物的化学成分特点和功能，为烟草腺毛的改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

普通烟草TI1068和TI35是由美国农业部牛津烟草研究所（Oxford Tobacco Research Station，Oxford，North Carolina，USA）提供的，且是从美国本土以外收集到的普通烟草（N.tabacum）栽培品系。

1.2 烟草叶片表皮毛的形态比较

在烟株成熟期，选择长势一致的4棵烟株，选取叶长约10 cm的顶叶，在质量体积分数为0.2%的罗丹明B水溶液中浸染30 min，后用蒸馏水漂洗3次，冲洗未结合的染料，吸干表面水分。避开叶脉切取叶中部约5 mm×8 mm叶片，在超景深显微镜（VHX-5000，日本基恩士公司）下观察叶片的表皮毛形态和数量，随机选择10个视野进行腺毛密度统计和分析。

1.3 叶面化学成分分析

在烟株成熟期，选择长势一致的4棵烟株，选取第10～12位（从下向上数）中部叶提取叶面化学物质。避开主脉位置，取直径为10 cm的叶圆片20片，采用有机溶剂萃取的方法提取烟叶的叶面化学物质［14］。将叶圆片在二氯甲烷中依次浸提2 s，重复8次后加入1 mL内标（2.020 mg/mL蔗糖八乙酸酯和2.474 mg/mL正十七烷醇的混合液），旋转蒸发仪浓缩，氮吹仪吹干。加入500 μL体积比为1 ∶1的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA），在75 ℃水浴中进行60 min衍生化反应，加入N，O-双乙酰胺和吡啶各125 μL，获得待测液。利用GC/MS（色谱仪型号HP-5890，质谱仪型号vc-70SE，美国Agilent公司）进行化学成分的定性和定量分析，色谱参数条件参考文献［15］的方法。

1.4 半定量RT-PCR分析

在烟株成熟期，选择长势一致的4株烟，取长约10 cm的顶叶，去除叶脉后混合烟样。按照Invitrogen Trizol Reagent说明书提取总RNA，然后反转录合成cDNA。以L25作为内参基因，采用半定量RT-PCR方法分析西柏烷二萜合成基因GGPPS、CBTS和CYP71D16的表达量。在NCBI的Gene数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）检索GGPPS、CBTS和CYP71D16的序列。将获得的每个基因家族序列进行序列比对，利用Primer 5.0在基因保守域设计引物，GGPPS-F：5′-TGTCGATTC ATGGGCTGCT-3′，GGPPS-R：5′-GTGGATCACAGG TGGGTCTTT-3′；CBTS-F：5′-CGACTTGCGAGGC AACAAGG-3′，CBTS-R：5′-GAGCGAATTCCATG TTCAATGAC-3′；CYP71D16-F：5′-TGTACTGCTA AGACTTATGA-3′，CYP71D16-R：5′-GGTTTCGA GTTCGTCCATT-3′；L25-F：5′-CCCCTCACCACA GAGTCTGC-3′，L25-R：5′-TTCTAACTCCTGTTGTT GTGGGAA-3′。PCR反应条件：95 ℃5 min；95 ℃40 s，60 ℃50 s，72 ℃30 s，28个循环；72 ℃5 min。

1.5 蚜虫嗜好性比较

取TI1068和TI35大小相近的幼叶（15～20 cm）置于同一培养皿（直径25 cm）中，为避免叶片在试验过程中失水，用湿润的脱脂棉将叶柄包裹，培养皿底部放置6层浸透无菌水的滤纸。将100头蚜虫等距放于叶片之间，不限制蚜虫的自由活动。将培养皿放置于25 ℃恒温人工气候箱（RXZ-500，宁波江南仪器厂）12 h，每隔3 h统计叶片上的蚜虫数量，设置3次重复，计算平均值。

2 结果与讨论

2.1 烟草叶片表皮毛的形态比较

烟草TI1068和TI35叶片表皮毛的形态学观察结果见图1。TI1068和TI35同时具有长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛3种类型表皮毛。TI1068的腺毛以长柄腺毛为主，腺毛头部膨大，由多细胞组成，整个腺头被分泌物包裹成球形或水滴形，含有极少量的保护毛（图1A，B）。TI35的表皮毛以保护毛为主，顶部细胞与柄细胞结构无差异，TI35的长柄腺毛量甚少（图1C，D）。TI1068和TI35的短柄腺毛形态无差异，柄细胞均为单细胞，腺毛头部膨大呈圆球形，分泌物不及长柄腺毛多。因此，TI1068的腺毛分泌物远多于TI35。

罗丹明B水溶液染色试验结果（图2）显示，保护毛不能着色；长柄腺毛和短柄腺毛可以被罗丹明B水溶液染红；总体来看，长柄腺毛的着色程度比短柄腺毛深。可见，长柄腺毛和短柄腺毛均有糖酯分泌，而长柄腺毛的糖酯含量或种类多于短柄腺毛。显微镜下统计叶面表皮毛的密度发现，TI1068总腺毛密度高于TI35，但未达到显著水平；TI1068的长柄腺毛密度极显著高于TI35，约为TI35的10倍；TI35保护毛密度极显著高于TI1068，约为TI1068的7倍；TI1068和TI35的短柄腺毛数量无显著差异。

2.2 烟草叶面化学成分分析

图1 烟草TI1068和TI35叶片表皮毛的形态比较Fig.1 Morphological comparison of trichomes on leaf surface between TI1068 and TI35

图2 烟草TI1068和TI35叶片表皮毛密度的比较Fig.2 Comparison of trichome densities on leaf surface between TI1068 and TI35

西柏烷二萜、烷烃和蔗糖酯是烟草叶面分泌物的主要化学成分［16-17］。叶面化学成分分析结果（表1）显示，TI1068和TI35的叶面分泌物成分相似，均含有西柏烷二萜、烷烃和蔗糖酯。TI1068中3种成分总量约是TI35的10倍，而各成分含量存在差异。TI1068：西柏烷二萜（66%）＞蔗糖酯类（24%）＞烷烃类（10%）；TI35：烷烃类（94%）＞西柏烷二萜（5%）＞蔗糖酯类（1%）。

通过对TI1068和TI35叶面化学成分的比较发现，TI1068叶面成分主要是西柏烷二萜和蔗糖酯，而TI35主要是烷烃类，仅存在微量的西柏烷二萜和蔗糖酯Ⅳ。此外，TI1068和TI35的烷烃种类和总量无差异。考虑到TI1068和TI35的表皮毛类型差异，即TI1068以长柄腺毛为主，TI35以保护毛为主，短柄腺毛数量无差异，因此推测长柄腺毛是西柏烷二萜和蔗糖酯合成的主要场所，而烷烃类主要在短柄腺毛合成。腺毛分泌物对于烟草品质和抗性有重要影响［18］。有研究发现喷施茉莉酸甲酯可以促进长柄腺毛的发生，增加叶面分泌物含量，进而增强叶片对蚜虫的驱避性［19-20］；敲除烟草NtCycB2基因可以增加长柄腺毛的密度，提高西柏烷二萜含量，进而改善烟叶品质和抗性［21-22］。这些研究结果表明，不同腺毛类型对腺毛分泌物的贡献不同，长柄腺毛是西柏烷二萜合成的主要场所，增加长柄腺毛密度是提高烟叶品质和抗性的重要途径。

表1 烟草TI1068和TI35叶面化学成分比较Tab.1 Comparison of leaf surface chemical components between TI1068 and TI35

表1 （续）

2.3 烟草西柏烷二萜合成基因的表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）是合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）的关键酶［23］，GGPP合成西柏烷二萜分为两步：首先，GGPP在西柏三烯醇合酶（cembratrienol synthase，CBTS）的催化下发生环化反应，形成α-西柏三烯一醇和β-西柏三烯一醇；然后，西柏三烯一醇在细胞色素CYP450加氧酶（Cytochrome P450 hydroxylase，CYP450）的催化作用下，第6位碳发生羟化反应形成α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇，该酶的编码基因为CYP71D16［24］。

采用半定量RT-PCR方法分析TI1068和TI35中西柏烷二萜合成基因的表达量结果见图3。从图3中可以看出，GGPPS、CBTS和CYP71D16在TI1068中的表达水平均高于TI35。这与表皮毛的形态比较和叶面化学成分分析结果一致，即长柄腺毛是西柏烷二萜合成的主要场所，TI1068具有高密度的长柄腺毛，而TI35仅有微量的长柄腺毛。

图3 烟草TI1068和TI35西柏烷二萜合成基因的表达分析Fig.3 Expression analysis of genes related to diterpenoid biosynthesis in TI1068 and TI35

2.4 蚜虫嗜好性比较

图4 烟草TI1068和TI35的蚜虫嗜好性比较Fig.4 Comparison of aphid preference between TI1068 and TI35

TI1068和TI35离体叶片上的蚜虫数量见图4。在各检测时段TI35叶片的蚜虫数量是TI1068的4～6倍。有研究表明，烟草腺毛可以特异地合成西柏烷二萜化合物，该化合物不仅具有抗真菌和抗蚜虫活性，还可作为活性剂刺激烟草夜蛾产卵，其对于幼虫的生长具有毒害作用［25-26］；提高烟草腺毛中西柏三烯一醇含量可提高烟草的抗蚜虫能力［27-28］。本研究中TI1068的蚜虫嗜好性极显著低于TI35，其原因可能是由于TI1068中西柏三烯一醇含量是TI35的57倍。

3 结论

①TI1068和TI35均有长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛3种表皮毛类型；TI1068以长柄分泌型腺毛为主，含有少量保护毛，TI35以非分泌型表皮毛为主，含有微量的长柄腺毛；TI1068和TI35的短柄腺毛数量无显著差异。②烟草TI1068和TI35叶面化学成分中均有西柏烷二萜、蔗糖酯和烷烃；TI1068叶面上3种物质含量约为TI35的10倍；TI1068叶面主要化学成分是西柏烷二萜和蔗糖酯类物质，而TI35主要是烷烃类，仅存在微量西柏烷二萜和糖酯Ⅳ。③西柏烷二萜合成基因GGPPS、CBTS和CYP71D16在TI1068中表达水平均高于TI35。④蚜虫对TI1068的嗜好性极显著低于TI35。