IVF-ET中注射HCG后不同授精时间对受精结局的影响

汪佳星，王良盛，龙 平，毛记龙，黄元华

(1.海南医学院第一附属医院海南省人类生殖与遗传重点实验室，海南医学院第一附属医院生殖医学科，海南医学院第一附属医院海南省地方病(地中海贫血)临床医学研究中心，海南医学院第一附属医院海口市人类遗传资源保藏重点实验室，海南 海口 570102；2.海南医学院第一附属医院脊柱骨病科，海南 海口 570102)

在生理条件下，卵母细胞在卵泡刺激素(follicular stimulation hormone，FSH)作用下胞浆发育成熟，在黄体生成素(luteinizing hormone，LH)峰值作用下细胞核减数分裂恢复并成熟。在体外受精-胚胎移植(Invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)过程中常注射外源性绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)模拟LH峰来促进卵母细胞成熟并诱发排卵[1]，而卵母细胞受精能力及功能与其成熟状态密切相关；成熟不足和过熟状态都将影响受精和胚胎发育[2，3]。目前HCG注射后34～36 h进行常规取卵，但HCG注射后授精的时间尚未达成共识。本研究采用回顾性分析方法研究HCG注射后授精时间与早期胚胎发育及临床结局之间的关系，探索HCG注射后的最佳授精时间，为优化IVF- ET实验室操作规程、提高临床治疗效果和安全性提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组

将2016年1月～2018年8月在本院生殖中心接受IVF-ET治疗的患者作为研究对象。 纳入标准：(1)女方因输卵管因素不孕；(2)女方年龄≤38岁；(3)注射HCG后受精时间在38～42 h；(4)男方精液质量达到IVF-ET标准[4]。排除标准：(1)多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)；(2)卵巢功能衰退；(3)子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)；(4)生殖器结核；(5)子宫畸形或染色体异常。

根据HCG注射后的授精时间分为A组：注射HCG后38～39 h授精(含39 h)；B组：注射HCG后39～40 h授精(含40 h)；C组：注射HCG后40～41 h授精(含41 h)；D组：注射HCG后41～42 h授精(含42 h)。

1.2 方法

1.2.1控制性超促排 本中心常用的促排方案包括长、超长、短、微刺激及拮抗剂方案。(1)长方案：于黄体中期开始使用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a) (1.25～3.75 mg/d，达菲林/抑那通)。在2周后通过阴道超声检查和黄体生成素( LH)、E2及 孕激素(P)水平的检测，达降调节的标准后开始启动促性腺激素(gonadotropin，Gn) (150 ～225 IU/d，果纳芬/丽申宝)。(2)超长方案：于月经周期的第2～3天使用长效 GnRHa (3.75 mg/d，达菲林/抑那通)，经过1～3个周期降调节后经阴道超声检查和LH、E2及 P水平检测，达完全降调节后启动Gn (150～225 IU/d，果纳芬/丽申宝)。(3)短方案：于月经周期第2天注射GnRH-a (0.1 mg/d，达菲林/抑那通)，第3天开始加用Gn (150～225 IU/d，果纳芬/丽申宝)，第4天开始监测卵泡生长情况，第6天检测LH、E2及P水平。(4)微刺激方案：于月经周期第2天开始口服CC (50 mg/d，克罗米芬)或LE (2.5 mg/d，来曲唑)，与Gn (150～225 IU/d，果纳芬/丽申宝)联合使用促进卵泡的生长。(5)拮抗剂方案：于月经周期的第2天，使用Gn (150～225 IU/d，果纳芬/丽申宝)来启动促排卵；在给药后的第6天监测卵泡生长情况，并检测LH、E2和P水平；当优势卵泡直径达到12～14 mm时加用促性腺激素释放激素拮抗剂(gonadotropin re-leasing hormone antagonist，GnRH-ant) (0.25 mg/d，思则凯)。以上5种方法均在启动Gn后根据卵泡的直径大小、卵泡的个数及激素水平适时对用药方案进行调整。其中卵泡成熟标准：当有至少1个卵泡的直径≥18 mm提示卵泡成熟，此时停用Gn并在当晚(21:00～24:00)肌内注射HCG (5 000～10 000 IU，丽珠)或艾泽(250 μg，默克雪兰诺)进行扳机处理。

1.2.2取卵及卵母细胞的培养 在注射HCG后34～36 h阴道超声引导下进行取卵操作，依次抽取两次侧卵巢中直径≥10 mm的所有卵泡[5]。取出的卵母细胞取置于HTF培养液(Quinn's，1020)进行相应的培养。

1.2.3体外授精 采用密度梯度离心法结合上游法处理后[6]，将卵子与精子数按1∶10万比例放入受精液(K-SIFM-100，COOK或G-IVF PLUS，Vitrolife)中，置于三气培养箱进行授精培养。

1.2.4胚胎培养及评级 于恒温倒置显微镜下观察在受精后16～20 h、25～26 h、42～44 h及66～68 h观察胚胎发育的情况，当出现双原核(2PN)为正常受精的标志。胚胎评级的标准[4，7]：根据卵裂球的大小、规则性及碎片的存在与否分为I～Ⅳ级。

1.2.5胚胎移植及移植后处理 取卵后第3天根据患者情况，按国家相关的规定来决定胚胎移植数量。移植两周时将尿液HCG呈阳性定为生化妊娠，移植5周时B超检提示妊娠囊和胚芽视为临床妊娠。

1.3 统计学处理

应用SPSS22.0软件对所收集的数据进行统计学分析。计量资料采用非参数检验，并表示为中位数±四分位数间距(M±Q)；组间多个率的比较采用行×列表χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况比较

该研究共包括1 140例IVF-ET周期。从表1可见各组间患者的年龄、不孕年限、体重指数(Body mass index，BMI)、FSH、LH、P分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组一般情况及激素水平比较(M±Q)

2.2 各组受精结局比较

对患者受精结局包括实验室指标及临床指标进行比较，发现组间差异无统计学意义(P>0.05)。但是，对于正常受精率：A组(65.9%)

2.3 在最佳授精时间内不同促排卵方案患者受精结局评估

IVF-ET患者在HCG注射后41～42 h可获得更好的妊娠结局，其促排方案主要包括长方案(n=119)、超长方案(n=108)及拮抗剂方案(n=39)。对3种促排方案患者的受精结局进行分析，结果发现正常受精率：拮抗剂方案(78.1%)>超长方案(72.3%)>长方案(69.6%)，其差异均具有统计学意义(χ2=7.905，P=0.019)；与长方案、超长方案患者相比，拮抗剂方案患者的早期流产率最低，但组间无统计学差异(P>0.05)。同时发现长方案患者的2PN卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎着床率均高于其它两组患者，但组间无统计学差异(P>0.05) 。见表3。

表3 不同促排方案患者受精结局比较(%)

3 讨论

体内卵母细胞的成熟是一个复杂的过程，涉及细胞核和细胞质以及透明带的成熟。在IVF-ET治疗中卵母细胞最终的成熟需要注射外源性HCG来模拟LH峰的激发，从而促进卵母细胞的最终成熟并诱发排卵[8，9]。然而HCG注射后卵母细胞的授精时机是影响IVF妊娠结局的重要因素之一[10-12]。如果授精时机过早，卵母细胞的细胞核和细胞质可能没有达到同步成熟，导致纺锤体等细胞减数分裂相关的细胞器出现异常而无法为精卵结合提供充分的准备，从而影响妊娠的结局[11]；如果授精时机太晚，卵母细胞可能因为过度成熟，导致纺锤体等细胞减数分裂相关的异常细胞器增多，从而错过了最佳授精时机，影响妊娠的结局[12]。

目前，关于HCG注射后的授精时间并没有统一，且国内外相关研究较少。以往研究发现在 HCG注射后39～40 h进行授精，可以获得较好的妊娠结局；认为此阶段可能更有利于卵母细胞的核质同步化成熟，有助于精卵的正常结合[2]。有研究表明，成熟卵母细胞纺锤体的出现与HCG注射后的时间有关，且具有时间依赖性；在39～40.5 h可发现大多数MⅡ卵母细胞出现纺锤体，推测ICSI助孕患者在此时为HCG注射后最佳的授精时间[13-15]。有研究显示，若卵母细胞在体外培养时间过长，可能会破坏纺锤体等结构及卵裂的异常，从而降低胚胎的发育能力[16-18]。然而殷宝莉等[19]对ICSI助孕的患者进行研究，其结果表明HCG注射后41～42 h行ICSI授精后患者的临床妊娠率、胚胎种植率相对较高，早期流产率则最低；注射HCG后42～43 h和≥43 h ICSI授精患者临床妊娠率、胚胎种植率则开始出现下降的趋势，早期流产率开始升高。近期有学者对 IVF-ET助孕患者HCG注射后不同的授精时间进行研究，在HCG注射后38～42 h范围内授精发现41～42 h期间患者的优质胚胎率和可利用胚胎率最高，并且可获得较好的临床妊娠率及较低的早期流产率[20]，其结果与本研究关于IVF-ET助孕患者对HCG注射后授精时间的研究结果是一致的。同样其他学者研究发现，IVF-ET助孕患者HCG注射后40～41 h受精可提高胚胎着床率和临床妊娠率[21]。然而在本研究的结果中发现，在38～42 h的范围内授精，患者的正常受精率和优质胚胎率随着HCG注射后授精时间的延长而呈增长趋势；并且发现2PN卵裂率在41～42 h范围内较高，这说明如果适当延长HCG注射后的授精时间，有可能利于胚胎发育从而提高早期胚胎的质量；同时发现在HCG注射后41～42 h授精，其胚胎着床率和临床妊娠率最高、早期流产率相对较低，提示在此时授精可能会获得更好的临床结局。此外本研究分析了HCG注射后41～42 h授精的IVF-ET患者不同促排卵方案对妊娠结局的影响，结果发现拮抗剂方案患者的正常受精率明显高于其它方案，并且其早期流产率最低；而长方案在2PN卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率及胚胎着床率方面具有优势，但是其早期流产率最高。近期有研究探讨了GnRH-ant拮抗剂方案联合HCG对临床结局的影响，认为少量添加HCG有利于提高优胚数等[22],此外有研究也表示对于卵巢高反应患者采用拮抗剂联合HCG诱发排卵不仅可获得较好结局，并且不增加OHSS的发生率[23]。 这说明IVF-ET患者在拮抗剂方案启动促排的基础上，结合HCG注射后最佳的授精时间，可获得更好的妊娠结局。

然而，不同生殖中心其治疗方案、用药及实验室培养体系等存在差异，临床上患者促排方案也存在差异，因此在IVF-ET治疗中HCG注射后的最佳授精时间可能不同。在未来关于HCG注射后授精时间的研究中，仍有必要继续扩大样本量，并对多种助孕方式进行分析，同时开展多个生殖中心的前瞻性随机对照研究；获得更客观准确的结论，应用于生殖领域。