调治天癸方对雷公藤多苷致少弱精症大鼠精子质量及Fas表达的影响研究

朱文雄，袁轶峰，孙弘本，刘 涛，陈其华，贺菊乔

(1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

少弱精症是引起男性不育的极为常见病因，但其发病机制仍不十分明确，临床缺少有效的治疗手段。近些年来，许多医家开始研究依靠中医辨证、采用中医方剂及相关中医制剂来治疗少弱精子症的方法，并取得了显著疗效[1-3]。调治天癸方是我院国家级名老中医贺菊乔教授以“肾-天癸-肾子轴”[4]为理论基础制定且经多年临床应用治疗少弱精症的验方，功可滋养肝肾，益气填精。本实验通过雷公藤多苷建立少弱精症大鼠模型，观察了调治天癸方对少弱精症大鼠精子质量及Fas表达的影响，旨在为该方的应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量300～330 g，由北京科宇动物养殖中心提供，动物许可证号：SCXK(京)2018-0010。

1.2实验药物 调治天癸方由黄芪15 g、黄精15 g、菟丝子15 g、枸杞子15 g、车前子10 g、熟地黄15 g、山茱萸10 g、紫河车9 g等组成，由湖南中医药大学第一附属医院中药房统一提供并熬制成药液。生精胶囊由遵义廖元和堂药业有限公司提供，国药准字Z20027672，规格：0.4 g/粒，产品批号：20170905。

1.3实验试剂 PMSF，Amresco生产，货号：329-98-6；羊抗鼠-HRP，Abmart生产，货号：M21001L；cocktail，上海源叶生产，货号：10557；溴酚蓝，Amresco生产，货号：BO449-5G；β-actin，杭州华安生产，货号：1854-s；三硫叔糖醇(DTT)，Biosharp生产，货号：Amresco0281；甘油，国药集团化学试剂有限公司生产，货号：10010618；SDS，国药集团化学试剂有限公司生产，货号：30166428；marker，TransGen Biotech生产，货号：DM111；PVDF膜(0.45 μm)，Millipore生产，货号：IPVH00010；ECL底物液，Thermo生产，货号：NCI5079；Beta-actin，abcam生产，货号：Ab8226。

1.4实验主要仪器 电泳仪，Tanon生产，型号：EPS300；酶标仪，Thermo生产，型号：muLISKANMK3；PH计，德国Metter-Toledo GmbH公司生产，型号：LP115；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司生产，型号：CPA；水平摇床，ORBITAL SHAKER生产，型号：TS-1000；磁力搅拌器，江苏省金坛市中大仪器厂生产，型号：T8-1；4 ℃离心机，Eppendorf生产，型号：Centrifuge 5415R。

1.5动物分组、造模及干预 将72只雄性SD成年大鼠随机分为正常组、模型组、生精胶囊组和调治天癸方高、中、低剂量组，每组12只。适应性饲养1周后，除正常组继续给予正常饮食外，其余组参考文献[5-6]方法，连续给予雷公藤多苷片20 mg/(kg·d)灌胃5周建立少弱精症模型。造模成功后,调治天癸方高、中、低剂量组给予调治天癸方水煎液3.38 g/(100 g·d)、1.69 g/(100 g·d)、0.85 g/(100 g·d)灌胃，生精胶囊组给予生精胶囊粉末0.06 g/100 g加等量温开水(水温40～50 ℃)充分搅拌后灌胃，正常组及模型组给予等量生理盐水灌胃，均每日2次，连续灌胃5周。

1.6取材 上述动物于末次灌胃结束后48 h内，参考文献[5]方法，应用戊巴比妥钠0.1 g溶于2 mL生理盐水中腹腔注射麻醉大鼠，摘取大鼠睾丸及附睾，然后脱颈处死。摘取的睾丸组织在-80 ℃冰箱中保存。将一侧附睾取尾部放入2 mL提前预热好至37 ℃的生理盐水中，将其剪碎并静置2 min，收集附睾尾精子，制备精子混悬液。

1.7精子质量检测 按照文献[7-8]方法，取100 μL精子混悬液，加入1 mL 37 ℃的生理盐水中稀释，37 ℃恒温水浴2 min，之后取10 μL加到预温的血细胞计数板上，选取6个视野，于2 min内应用计算机辅助精子分析方法检测精子密度和精子活动率。

1.8睾丸组织中Fas表达检测 采用Western blot法检测大鼠睾丸组织中Fas蛋白表达情况。首先在基础裂解液中加入PMSF、cocktail 、Triton-100和NaVO3制备蛋白裂解液，将各组大鼠睾丸组织取出后裂解制备样品，将制得的样品进行SDS-PAGE电泳。然后进行转膜：将剪切好的PVDF膜放到甲醇中浸泡2 min；取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜。转膜过程在4 ℃进行，转膜条件为100 V/100 mA。通过ECL显色系统实现免疫印迹显色，具体操作方法：首先用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。再用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。之后TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次，以洗去多余一抗。然后用封闭液稀释HRP标记二抗(1∶1 000稀释)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h。同前方法洗去多余二抗。而后将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X射线胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。最后晾干胶片并扫描，分析各胶片的灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠附睾精子质量比较 模型组大鼠精子密度、精子活动率均明显低于正常组(P均<0.05)；生精胶囊组及调治天癸方各剂量组大鼠精子密度、精子活动率均明显高于模型组(P均<0.05)，且调治天癸方各剂量均明显高于生精胶囊组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠附睾精子质量比较

2.2各组大鼠睾丸组织中Fas蛋白表达水平比较正常组、模型组、生精胶囊组及调治天癸方高、中、低剂量组睾丸组织中Fas蛋白表达水平分别为0.20±0.08，1.03±0.06，0.73±0.06，0.20±0.08，0.36±0.07，0.61±0.10，灰度图见图1。模型组Fas蛋白表达水平明显高于正常组，生精胶囊组及调治天癸方各剂量组均明显低于模型组，调治天癸方各剂量组均明显低于生精胶囊组，且调治天癸方高剂量组明显低于调治天癸方中剂量组，调治天癸方中剂量组明显低于调治天癸方低剂量组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

A为正常组；B为模型组；C为生精胶囊组；D为调治天癸方高剂量组；E为调治天癸方中剂量组；F为调治天癸方低剂量组

3 讨 论

在正常的精子发生过程中，生精细胞凋亡是维持精子质量和数量的保证，但过度的凋亡则是导致少精和弱精的主要原因。这一现象受多种基因调控，其中Fas与Fas-L衔接可触发生精细胞的生理性凋亡，这是Fas/FasL系统介导哺乳动物睾丸生精细胞凋亡的主要途径。Fas-L特异性的与生精细胞膜上Fas结合后，通过胞内肽段的死亡结构域激活相关的半胱天冬氨酸酶(Caspase-3) 级联反应，诱导其凋亡[9]。Fas/FasL系统调节功能与男性生精功能密切相关[10-11]。

雷公藤多苷由植物雷公藤中分离而出，雷公藤制剂具有生殖毒性，可导致男性性欲减退、精子活力下降、少精或无精，长期用药还可能导致睾丸萎缩等[12-13]。本实验结果及文献[5,12,14-15]均显示雷公藤多苷可显著降低精子活力、活率，可促进Fas表达。

少弱精症在病因病机上有相互关联的部分，但又有其不同之处。所谓精薄清冷，其实不能一概而论。少精症多属中医学“虚劳”范畴，巢元方在《诸病源候论》中提到“肾主骨髓，而藏于精。虚劳肾气虚弱，故精液少也”，即虚劳少精候，可以为之证。而弱精症多属中医学“精寒”“精冷”范畴，因为阳者主升主动，故中医辨证总属阳虚范畴。调治天癸方中黄芪善补一身之气；黄精长于益气填精，《圣记总录》记载：“常服精天草(黄精)能助气固精，补填丹田、益脾益肾、润心肺、驻颜”，与黄芪合用，补气生精，为生育提供动力及物质基础；枸杞子填精补血、平补肝肾，菟丝子益肾精、补肾阳，车前子淡渗泄浊，使全方补而不滞，三药合用，正合五子衍宗丸方义，共奏补肾益精之功；肝经环绕阴器，肾脏主司生殖，熟地黄、山茱萸补益肝肾之阴，是治疗肝肾虚证的经典药对；紫河车为血肉有情之品，味甘咸，气大温，功可温肾阳补肾精，益气养血。全方切中病机，临床应用效果较好。

生精胶囊是中华医学会男科学分会推荐的治疗男性不育症的药物[16]，由鹿茸、枸杞子、人参、冬虫夏草、菟丝子、沙苑子、淫羊藿、黄精、何首乌、桑椹、补骨脂、骨碎补、仙茅、金樱子、覆盆子、杜仲、大血藤、马鞭草、银杏叶组成，组方以补肾温阳填精为治疗法则。现代临床研究表明生精胶囊具有调节下丘脑-垂体-性腺轴、抗氧化等功能，可改善精子质量[17-18]，故选择其为本实验的阳性对照药物。

本实验结果显示，生精胶囊组及调治天癸方各剂量组大鼠精子密度、活动率均高于模型组，睾丸组织中Fas蛋白表达水平均低于模型组，且调治天癸方各剂量组较生精胶囊组改善更明显，且调治天癸方高、中、低剂量组Fas蛋白表达水平呈剂量依赖性降低。提示调治天癸方可明显改善雷公藤多苷致少弱精症大鼠的精子质量，抑制睾丸组织中Fas的表达。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。