不同标本类型检测新型冠状病毒核酸的临床研究

邓 傲，夏 雨，黄光成,2，费中海，许 媛,2，方 莉,2△

1.川北医学院附属医院医学检验科，四川南充 637000；2.川北医学院医学检验系，四川南充 637000

2019年12月底，湖北省武汉市持续开展流感及相关疾病监测，发现多起新型冠状病毒感染的肺炎案例，新型冠状病毒肺炎存在人传人现象[1-3]。2020年1月12日，中华人民共和国国家卫生健康委员会将该病毒被命名为2019nCoV，将“新型冠状病毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”，英文名称为“Novel Coronavirus Pneumonia”，简称“NCP”。后来世界卫生组织宣布，将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”，国际病毒分类委员会声明，将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”。为比较不同标本类型的核酸检测效果，本研究对川北医学院附属医院2020年1月28日至3月4日检测的1 851例标本进行研究，分析其不同标本类型的阳性检出率。

1 资料与方法

1.1标本 收集川北医学院附属医院2020年1月28日至3月4日所有SARS-CoV-2核酸检测标本共1 851例，其中痰液标本419例，咽拭子标本1 358例，粪便标本74例。同时收集10例已确诊的COVID-19患者相关资料，将其编号为202001-202010。

1.2试剂 提取试剂为上海之江生物科技股份有限公司核酸提取试剂Z-ME-0044，扩增试剂为上海之江生物科技股份有限公司的SARS-CoV-2三靶标核酸检测试剂盒及实验室检测技术指南[4]推荐的引物探针，检测位点为ORF1ab、N、E基因。

1.3仪器 核酸提取仪器为上海之江生物科技股份有限公司EX3600半自动核酸提取仪，实时荧光PCR扩增仪为上海宏石医疗科技有限公司全自动医用PCR分析系统SLAN-96P。

1.4方法

1.4.1标本前处理 咽拭子标本：取咽拭子头部放入含3 mL病毒保存液的病毒保存管中，置于振荡仪上振荡混匀备用；痰液标本：根据痰液黏稠程度，吸取约500 μL痰液于3 mL病毒保存管中，反复颠倒振荡混匀备用；粪便标本：用一次性拭子蘸取黄豆大小粪便于3 mL病毒保存管中，反复颠倒振荡混匀静置备用。

1.4.2核酸提取 取300 μL预处理后的待测标本加入核酸提取板的裂解液孔，同时在裂解液孔中加入20 μL蛋白酶K、6 μL RNA助沉剂、1 μL内标，放入半自动核酸提取仪中进行RNA提取。

1.4.3核酸扩增 扩增体系为19 μL PCR扩增液+1 μL Taq酶+5 μL模板。扩增程序为：45 ℃×10 min，95 ℃×30 s；95 ℃×15 s，58 ℃×30 s，45个循环。置SLAN96P实时荧光定量PCR扩增仪检测，单点荧光检测在58 ℃，荧光通道选择FAM、HEX、ROX、CY5。FAM通道检测ORF1ab基因，HEX通道检测N基因，ROX通道检测E基因，CY5通道检测内参基因。

1.4.4结果判读 结果判断标准：在FAM、HEX、ROX通道中，若Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则结果判读为该通道检测的基因阳性；若Ct值>43，或无数值，则该通道检测的基因为阴性。在CY5通道中，若Ct值>43，则提示标本质量存在问题或者操作存在问题，需重新采标，进行标本提取并检测。判断结果如下：ORF1ab基因(+)且N基因(+)，则SARS-CoV-2阳性；单ORF1ab基因或N基因(+)，需要重复测定，仍为阳性，则判为阳性；ORF1ab基因、N基因均为(-)，则SARS-CoV-2阴性。

1.5统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析处理。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1SARS-CoV-2核酸检测结果分析 对1 851例SARS-CoV-2核酸标本检测结果分析发现，3种不同标本类型阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05)，其中粪便标本阳性检出率最高，为8.11%；痰液标本阳性检出率次之，为5.49%。痰液标本与咽拭子标本阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=496.19，P<0.05)；痰液标本与粪便标本阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=241.43，P<0.05)；咽拭子标本与粪便标本阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=1 151.30，P<0.05)。见表1。

表1 SARS-CoV-2不同标本核酸阳性检出结果

2.210例已确诊COVID-19患者的核酸确诊标本类型分析 10例已确诊COVID-19患者的核酸确诊标本中，由痰液标本确诊病例为7例，占比70.00%；由咽拭子标本确诊病例为3例，占比30.00%；无粪便标本确诊病例。

2.310例已确诊COVID-19患者整个治疗过程中各标本阳性检测情况 分析10例已确诊COVID-19患者在整个治疗过程中所有标本类型核酸检测阳性情况，痰液标本阳性病例占80.00%(8/10)，咽拭子标本阳性病例占70.00%(7/10)，粪便标本阳性病例占50.00%(5/10)。痰液标本联合咽拭子标本阳性检出率达到100.00%。见表2。

表2 10例已确诊病例整个治疗过程中各标本检测情况

3 讨 论

COVID-19是突发的、危及全球的公共卫生事件。流行病学调查发现，SARS-CoV-2的传染源主要是感染SARS-CoV-2的患者和无症状感染者，同时家族聚集性病例的发现也预示SARS-CoV-2有人际传播能力[5-6]。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下也存在感染的可能[7]。COVID-19传染性强，供检测的标本类型多样，因此，快速锁定标本检测，提高检测效率有助于控制其暴发流行和保障人民生命安全。

本研究对1 851例SARS-CoV-2标本检测结果进行分析，粪便标本阳性检出率最高，为8.11%，可能与其标本特性有关，其一是粪便标本送检数少，仅有74例，占总数的4.00%；其二是粪便标本采集对象一般是确诊患者或疑似患者。在1 851例中以咽拭子标本为主，川北医学院附属医院的咽拭子标本主要来源于南充市周边3个县的疑似人员排查取样，考虑到人员众多且分散，故取样以咽拭子为主。

分析10例已确诊COVID-19患者的核酸标本类型发现，确诊标本类型以痰液标本为主，占70.00%，而咽拭子标本仅占30.00%，无粪便标本确诊。对比痰液和咽拭子两种标本的检测情况，该结果可能与SARS-CoV-2优先侵袭感染下呼吸道细胞有关[1]，进而产生的分泌物主要附着在痰液中，更易被检出。陈炜等[8]的研究提出，痰标本的病毒载量高于咽拭子，检出效果更优，预示对于早期感染SARS-CoV-2的患者其痰液标本更能提高SARS-CoV-2的确诊率，咽拭子标本可能存在漏诊情况。在对疑似人群进行筛查时除检测咽拭子标本外，尽可能同时检测痰液标本。

在10例已确诊COVID-19患者整个治疗过程中，痰液标本阳性病例最多，占80.00%，咽拭子标本次之，占70.00%，粪便标本占50.00%。粪便标本阳性率达50.00%应予以重视，同时，有患者在整个治疗过程中痰液标本/咽拭子标本一直是阴性而粪便标本阳性的情况(202005、202009)。在对感染SARS-CoV-2的患者出院检测及出院后随访检测时，除了检测痰液和咽拭子标本外，还应注重粪便标本的检测。吴冰珊等[9]的研究表明，有55.56%的确诊患者可排出SARS-CoV-2病毒，与本研究结果基本一致。比较10例COVID-19患者整个治疗过程所有标本类型的检测结果发现，痰液标本和咽拭子标本联合检测时阳性检出率达100.00%，结合粪便标本的特殊性，是否可以在COVID-19患者治疗过程中同时送检痰液、咽拭子和粪便标本作为其疗效监测和出院实验室诊断还有待进一步研究。

综上所述，本研究认为，在对疑似感染SARS-CoV-2人员的2次筛查排除时，最好同时送检痰液和咽拭子标本，减少假阴性情况发生。在COVID-19病例实验室确诊、疗效监测及出院实验室诊断时，以咽拭子标本核酸检测阴性作为排除感染及治愈标准在实施过程中需谨慎，最好采取痰液、咽拭子和粪便标本同时检测，并严格把控COVID-19患者分泌物的处理，严防病毒外漏。