人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的相关性及临床意义

韩加娥，程世亮，戴永刚，于 淼，王 园

1.山东省济南市天桥人民医院检验科，山东济南 250031；2.山东省立第三医院检验科，山东济南 250031

女性常见恶性肿瘤中发病率位居第2的是宫颈癌，位居首位的是乳腺癌[1]。世界卫生组织报道指出，宫颈癌每年的发病数量约50万；而在中国，每年宫颈癌的新发病例约为14万，给女性的生活及生命质量带来严重影响[2]。随着临床研究的不断深入，人乳头瘤病毒(HPV)开始逐渐进入到临床对宫颈癌的研究中，有研究表明，感染HPV是导致女性出现宫颈病变的一项主要原因[3]。目前临床已发现并证实的HPV基因亚型大概有100多种，其中与人类生殖道相关疾病有联系的共有40多种[4]。依据HPV基因亚型的不同致病能力，其主要分为低危型和高危型。感染HPV与机体免疫功能、性活跃程度及年龄均存在十分密切的联系。本研究采用PCR反向点杂交技术检测HPV基因亚型，探讨宫颈病变与HPV不同亚型之间的关系，为宫颈疾病的预防和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年在济南市天桥人民医院妇科就诊的864例宫颈病变患者作为研究对象，年龄18～60岁，平均(38.6±1.3)岁。所有患者均经HPV检测和宫颈病理活检。

1.2仪器与试剂 PCR扩增仪：罗氏480全自动实时荧光定量PCR仪。分子杂交仪：亚能生物技术(深圳)有限公司Combi_H12分子杂交仪。HPV基因分型检测试剂盒：亚能生物技术(深圳)有限公司生产的人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)。

1.3方法

1.3.1HPV-DNA标本采集 采用专用宫颈脱落细胞采集器进行采集，医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，取出宫颈刷置于宫颈口，单向旋转4～5周以获得足量的上皮细胞标本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好标识并直立放置。统一送至实验室进行检测。

1.3.2HPV-DNA提取 充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干，取1 mL洗脱液转移至1.5 mL离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃上清液，保留管底的细胞沉淀。加入50 μL裂解液悬浮沉淀，沸水浴加热10 min。13 000 r/min离心10 min，保留上清液待测。

1.3.3PCR扩增 取出PCR反应管，在管盖上做好标记，低速离心，分别加入已提取的待测标本DNA 5 μL，反应总体积为25 μL(可加入1滴矿物油防止蒸发)，低速离心。每次试验可设置一个阴性质量控制和一个阳性质量控制，作为产品使用的质量控制。PCR按以下条件进行扩增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；然后以94 ℃ 30 s；42 ℃ 90 s；72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.4杂交 取出15 mL塑料离心管，放入标有标本标号的膜条(应在膜条外用中性笔标记)，加入A液5～6 mL及所有(25 μL)的PCR扩增产物。将离心管放入沸水加热10 min(确保A液液面完全位于沸水液面以下)，取出再放入杂交箱51 ℃杂交至少1.5 h。取出50 mL塑料离心管，加入50 mL B液，于杂交箱或水浴箱中预热至51 ℃。阴性质量控制品和阳性质量控制品同步处理。

1.3.5洗膜 取出膜条，移至装有B液的50 mL离心管中，于51 ℃轻摇洗涤5 min。

1.3.6显色及HPV结果判定 按照HPV-DNA检测试剂盒说明进行杂交显色，显色结果按照说明书进行判断。膜条上探针按照规定序列排列，由蓝色斑点显现位置可判断HPV亚型。高危型18种，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4型。低危型5种,包括HPV 6、11、42、43、44型。感染HPV:一种HPV-DNA亚型出现阳性；多重感染：两种及两种以上HPV-DNA亚型出现阳性。

1.3.7宫颈组织病理活检 正常或炎症：标本检测结果提示仅存在炎症或正常；宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级：轻度不典型增生；CINⅡ级：中度不典型增生；CINⅢ级：重度不典型增生、宫颈癌[5]。

1.4观察指标

1.4.1观察所有人群宫颈病理活检结果及HPV阳性检出比率。

1.4.2观察不同宫颈病变中HPV常见基因亚型的分布情况。

1.4.3观察不同宫颈病变中单一HPV基因亚型阳性及多重HPV基因亚型阳性检出情况。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析处理。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1864例患者宫颈病理活检结果及HPV阳性检出结果 864例患者中，正常或炎症宫颈620例，CINⅠ级58例，CINⅡ级36例，CINⅢ级88例，宫颈癌62例。HPV阳性检出率随着宫颈病变程度不断加重而升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 所有患者宫颈病理活检结果及HPV阳性检出结果

2.2HPV常见基因亚型在不同宫颈病变中的感染情况 HPV 16型在正常或炎症中的阳性检出率为10.0%(62/620)，在CINⅠ级中的阳性检出率为13.8%(8/58)，在CINⅡ级中的阳性检出率为38.9%(14/36)，在CINⅢ级中的阳性检出率为34.1%(30/88)，在宫颈癌中的阳性检出率为77.4%(48/62)。伴随病情的不断发展，HPV 16型在不同宫颈病变中的阳性检出率逐渐升高。在宫颈癌患者中HPV 16型阳性检出率优最高，为77.4%(48/62)。HPV 18型在正常或炎症中的阳性检出率为5.2%(32/620)，在CINⅠ级中的阳性检出率为6.9%(4/58)，在CINⅡ级中的阳性检出率为5.6%(2/36)，在CINⅢ级中的阳性检出率为4.5%(4/88)，在宫颈癌中的阳性检出率为3.2%(2/62)。HPV 33型在正常或炎症中的阳性检出率为5.5%(34/620)，在CINⅠ级中的阳性检出率为6.9%(4/58)，在CINⅡ级中的阳性检出率为5.6%(2/36)，在CINⅢ级中的阳性检出率为13.6%(12/88)，在宫颈癌中的阳性检出率为4.8%(3/62)。HPV 52型在正常或炎症中的阳性检出率为2.6%(16/620)，在CINⅢ级中的阳性检出率为4.5%(4/88)，在宫颈癌中的阳性检出率为4.8%(3/62)。HPV 58型在正常或炎症中的阳性检出率为1.3%(8/620)，在CINⅡ级中的阳性检出率为38.9%(14/36)，在CINⅢ级中的阳性检出率为13.6%(12/88)。见表2。

表2 HPV常见基因亚型在不同宫颈病变中的感染情况(n)

2.3单一HPV基因亚型及多重HPV基因亚型在不同宫颈病变中感染情况 HPV多重感染在不同宫颈病变中的阳性检出情况：正常或炎症为11.3%(70/620)，CIN Ⅰ级为17.2%(10/58)，CINⅡ级为27.8%(10/36)，CINⅢ级为29.5%(26/88)，宫颈癌为9.7%(6/62)；宫颈癌中HPV多重感染占比明显更少，更多的是单一HPV基因型感染，且感染类型全部为高危型，见表3。

表3 单一HPV基因亚型及多重HPV基因亚型在不同宫颈病变中感染情况(n)

3 讨 论

目前，临床上已充分明确了宫颈癌与HPV之间的关系。HPV在早期复制及表达时会出现E6癌蛋白和E7癌蛋白，而在晚期时则会出现衣鞘蛋白L1和衣鞘蛋白L2[6]。假如机体持续性感染HPV，早期表达的E6癌蛋白就会使p53分解水平明显增加，进而使宫颈细胞特异性明显增加。E7癌蛋白会对E2F/pRb这一复合物产生干扰作用，主要作用是使拥有重要作用的转录因子E2F能被激活，导致发生翻译异常及HPV转录[7]。当损伤DNA时，会导致宫颈病变持续加重。本研究结果提示，HPV阳性检出率随宫颈病变程度的不断加重而升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。而在宫颈癌中HPV阳性检出率更是高达90.3%。

本研究结果显示，在不同类型宫颈病变中，HPV基因分型感染情况各不相同，不同亚型高危HPV基因其潜在的致病能力也各不相同，同时也反映了在不同宫颈病变中的流行性特征。相关研究指出，宫颈癌及CIN级中最常见的一种HPV基因亚型就是高危型HPV 16型，这与本研究结果一致[8]。本研究结果提示，在宫颈癌患者中同样也是HPV 16型的阳性检出率优势明显，为77.4%(48/62)。相关研究指出，连续性感染同一高危型HPV基因而导致的持续性感染，引发宫颈癌的风险最大[8]。有研究指出，针对常见的HPV 16、18、31、33型实施动态持续性检测，结果提示，HPV 16型与其他HPV基因亚型比较其持续性感染更加明显[9]。本研究结果提示，伴随病情不断发展，HPV 16型在不同宫颈病变中的感染率逐渐升高，分析其原因可能是因为HPV 16型更容易导致持续性感染，且机体很难将其进行清除[10]。HPV 16型是最常见的一种宫颈癌HPV基因亚型，一定要引起临床的重视及关注。

目前，针对多重感染HPV基因会导致宫颈病变的发生比率明显增加这一观点，临床上并无统一看法。有研究指出，多重感染表明，HPV基因会增加宫颈癌的发病风险，且会伴随宫颈病变的不断加重而增加HPV的感染率[11]。由此提示多重感染HPV基因亚型可能会导致机体更难对体内的相关病毒进行清除，使机体内持续性发生HPV感染，增加宫颈癌的发病风险[12]。本研究结果提示，宫颈癌中HPV多重感染占比明显更少，在宫颈癌中更多的是单一HPV基因型感染，分析其原因可能是因为此研究的标本病例数较少所致。

综上所述，随着宫颈病变程度的不断加重，HPV阳性检出率也随之逐渐升高；宫颈癌中HPV基因亚型主要包括HPV 16、33、52型。