血清GM在AIDS合并马尔尼菲篮状菌血症中的表达及早期诊断价值*

磨立达，奚少勇，罗晓璐

南宁市第四人民医院/广西医科大学附属南宁市传染病医院/广西艾滋病临床治疗中心(南宁)检验科,广西南宁530023

在东南亚和我国南方，马尔尼菲篮状菌(TM)是艾滋病(AIDS)患者最常见的机会性感染病原菌之一[1]，大多分布在循环系统和骨关节中，部分在呼吸道、消化道，其他部位也有报道，其中TM血症的病死率极高，可达100%。目前，确诊TM血症主要依靠传统的血液病原学培养,但耗时5～14 d，因此，建立快速、特异、灵敏的非培养法很有必要。半乳甘露聚糖(GM)试验为TM血症的早期诊断提供了可能。有研究表明，GM试验对马尔尼菲篮状菌病(PSM)有一定的诊断价值[2-3]，但针对AIDS合并TM血症的早期诊断研究甚少。本研究采用ELISA竞争法检测AIDS合并TM血症患者血清GM水平，以同期收治的AIDS合并其他侵袭性真菌感染(IFI)和排除IFI的非AIDS病例作为对照组，比较不同组别GM水平，通过给予不同的阳性界值,计算并评价诊断指标，观察血清GM在AIDS合并TM血症患者体内的表达水平，探索血清GM试验对TM血症的早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性收集2018年6月至2019年6月在南宁市第四人民医院住院的AIDS合并TM血症患者247例。入选标准：(1)经南宁市第四人民医院艾滋病确证实验室确证，符合2015年中华医学会感染病学分会艾滋病学组颁布的《艾滋病诊疗指南》[4]；(2)排除并发曲霉菌感染病例；(3)患者在真菌药物使用前或停药1周后，以及采血前3 d内无透析、插管、接受血小板输注和使用β-内酰胺类抗菌药物，在感染症状出现后抽取空腹静脉血分别注入不含GM的真空干燥管进行GM试验，以及血培养瓶进行真菌培养；(4)无菌操作抽取血液接种于血培养瓶，血培养仪报阳并涂片找出丝状真菌后，转种于2个真菌显色培养基，分别置于27.5 ℃和 35.5 ℃孵箱进行培养，观察两种温度下菌落形态、产色素情况，并进行棉兰染色，在高倍显微镜下对菌丝、孢子形态进行鉴别，确认病原体为TM，并得到临床支持；(5)经广西艾滋病临床治疗中心(南宁)伦理道德管理委员会审核，本项目设计方案科学，受试者风险/受益合理，均签署知情同意书。

1.2分组与方法 通过回顾性查阅患者住院临床资料，结合患者的真菌培养、真菌镜检、影像学、病理学等技术诊断，将血液培养出TM的AIDS患者247例作为TM感染组，男202例，女45例；平均年龄(46.38±13.40)岁；其中单纯TM感染181例，合并其他IFI 66例。对照组均来自同期在南宁市第四人民医院住院的患者，在真菌药物使用前或停药1周后，以及采血前3 d内无透析、插管、接受血小板输注和使用β-内酰胺类抗菌药物，包括264例AIDS合并其他IFI患者及926例排除IFI的非AIDS患者。264例AIDS合并其他IFI患者中曲霉菌感染患者12例作为曲霉菌感染组，均为男性，平均年龄(60.67±12.33)岁；单纯肺孢子菌感染患者82例，单纯念珠菌感染患者46例，单纯隐球菌感染患者13例，肺孢子菌和念珠菌双重感染患者84例，肺孢子菌和隐球菌双重感染患者10例，念珠菌和隐球菌双重感染患者8例，镰刀菌感染患者4例，阿萨毛希孢子菌感染患者5例，共252例作为其他IFI组，男189例，女63例，平均年龄(52.16±15.43)岁。排除IFI的非AIDS患者926例作为非IFI组，男615例，女311例，平均年龄(56.51±18.33)岁。以ELISA竞争法检测各组血清GM水平,比较2个实验组与各个对照组血清GM水平，通过给予不同的阳性界值,计算并评价诊断指标。

1.3GM检测方法 GM试验采用ELISA竞争法(诊断试剂盒为丹娜生物科技有限公司产品)。取患者空腹静脉血3 mL，分离血清；向离心管加入300 μL血清和100 μL样本处理液R5,震荡，100 ℃恒温浴3 min，4 ℃，13 000 r/min离心10 min；取上清液50 μL加入酶标板中，再加入GM抗体50 μL，封板，震荡，37 ℃孵育90 min；揭开封板膜，洗涤酶标板，共3次；加入酶标抗体100 μL，封板，37 ℃孵育30 min；洗涤酶标板，共3次；加入底物溶液100 μL，37 ℃孵育15 min；加入50 μL终止液，震荡，5 min内于酶标仪450 nm处读取A值。同时做空白对照，各孔A值减去空白对照孔A值为待检样本的A值，以GM水平为横坐标，A值为纵坐标，作直线拟合得到标准曲线方程，根据标准曲线方程计算待检样本和质控品的GM水平，同时认真做好室内质量控制。血清GM水平≥0.85 μg/L为阳性，灰区范围则为0.65～0.85 μg/L，线性范围为0.25～5.00 μg/L。

2 结 果

2.1各组患者血清GM水平比较 TM感染组患者血清GM水平为(0.80±0.77)μg/L，低于曲霉菌感染组的(1.70±1.07)μg/L，高于其他IFI组的(0.50±0.48)μg/L和非IFI组的(0.41±0.19)μg/L，差异均有统计学意义(t=3.614、4.455、10.012，P<0.05)；而其他IFI组患者血清GM水平与非IFI组比较，差异无统计学意义(t=1.917，P>0.05)。

2.2各组患者血清GM试验阳性率比较 当血清GM临界值分别为0.65、0.75、0.85 μg/L时，TM感染组患者血清GM试验阳性率分别为35.63%、29.55%、26.31%，均低于曲霉菌感染组，均高于其他IFI组和非IFI组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而其他IFI组患者血清GM试验阳性率与非IFI组比较，差异无统计学意义(χ2=0.577、0.963、1.802,P=0.564、0.336、0.071)。见表1。

表1 各组患者血清GM试验阳性率比较[n(%)]

2.3不同GM阳性临界值时TM感染组和非IFI组结果分析 当血清GM阳性临界值分别为0.65、0.75、0.85 μg/L时，TM感染组患者血清GM试验灵敏度分别为35.63%、29.55%、26.31%，特异度分别为85.96%、91.25%、94.82%，阳性预测值分别为40.37%、47.40%、57.52%，阴性预测值分别为83.35%、82.92%、82.83%，准确度分别为75.36%、78.26%、80.39%。见表2。

表2 不同GM阳性临界值时TM感染组和非IFI组结果分析评价

3 讨 论

AIDS合并TM血症临床症状与不少病原菌的血行性感染相似[3,5]，易混淆，可造成误诊，时常并发其他IFI，本研究并发率为26.72%。通常影像学能在第一时间对肺孢子菌感染作出诊断，念珠菌、隐球菌及阿萨毛希孢子菌等其他IFI总是先于TM被培养出来[6]，使后来的纠正性诊断耗费大量的时间。很显然，寻找快速诊断方法意义重大。

GM是曲霉菌属和青霉菌属等真菌细胞壁的特异组成成分，常在患者出现症状或影像特征前已能在血清或其他体液中检测到[7-8]。据文献报道，GM试验对曲霉菌属和青霉菌属的交叉反应率在70%以上[9]，而TM属于青霉菌属，因此，取患者血清进行GM试验对早期诊断AIDS 合并TM血症成为可能。本研究结果显示，TM感染组患者血清GM水平为(0.80±0.77)μg/L，明显低于曲霉菌感染组，明显高于其他IFI组和非IFI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示血清GM试验可作为AIDS合并TM血症的1项辅助诊断指标,并且可以与AIDS合并其他IFI(除曲霉菌感染外)进行鉴别诊断。GM试验采用ELISA竞争法，在2 h内可得出结果，对快速诊断AIDS合并TM血症提供了方便。

本研究结果显示，取3种GM不同阳性临界值时，TM感染组血清GM试验阳性率均小于36%，远远低于曲霉菌感染组的83.33%，提示此试验诊断AIDS合并TM血症的灵敏度较低。可能与以下原因有关：血液中的中性粒细胞能快速吞噬TM，降低体内TM存活率，同时肝肾代谢分解降低抗原活性，造成血中GM少且不持续；此外，中性粒细胞表面可能还存在相应的受体，可牢固结合GM，且遮蔽了与EB-A2单克隆抗体相结合的抗原决定簇，降低了GM试验的灵敏度。甚至有学者认为，早期TM感染主要在肺部，直至治疗阶段血液GM水平才升高[10]。使用伏立康唑或伊曲康唑等抗真菌药物经验治疗，对TM感染疗效不佳，但能在较长的一段时间内抑制其生长速度。MARR等[11]对67例患者的986份血清标本进行分析发现，未接受抗真菌治疗的患者ELISA检测的灵敏度可达80%，而经抗真菌治疗患者的灵敏度仅为20%。本研究统计，大多数研究对象未曾接受或较长时间未接受抗真菌治疗，而停止抗真菌治疗7 d左右的仅为20%，因此，作者认为，检测前一段时间的抗真菌治疗与GM试验的灵敏度关系有待探讨。本研究中AIDS合并TM血症患者血清GM试验阳性率仅为30%左右，是否与年龄、性别、生活习惯、地域等个体因素有关，需要进一步研究。

近年来，关于GM试验的假阳性一直备受关注。有文献报道，血清GM试验对其他如深红酵母菌、新生隐球菌、头地霉菌、顶孢霉菌、链格孢菌、郁金香葡萄孢菌、枝状枝孢霉菌、多主枝孢霉菌、尖镰孢菌及红色发癣菌等真菌也有交叉反应[12-13]。本研究结果显示，不管是肺孢子菌、念珠菌、隐球菌等为主的其他IFI组血清GM水平，还是其阳性率与非IFI组比较，差异均无统计学意义(P>0.05),提示这些真菌细胞壁上存在GM的可能性较小，意味着存在一定的假阳性。冯凯等[14]报道，假阳性与使用半合成青霉素有关。BOONSARNGSUK等[15]对半合成青霉素和头孢类等抗菌药物引起的血清GM试验假阳性进行统计，以GM水平>0.5 μg/L为临界值，阿莫西林/克拉维酸假阳性结果占26.7%，头孢吡肟占14.3%，而哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦假阳性结果所占比例分别高达58.3%、66.7%，由此可见抗细菌药物对GM试验影响很大。本研究中AIDS合并IFI患者常常并发细菌性或梅毒螺旋体感染，比例超过40%，这类患者通常用β-内酰胺类抗菌药物和抗真菌药物混合治疗。虽然停药3 d左右再行血清GM试验，但仍有部分残余，因此产生较高的假阳性。经过比较，阳性临界值为0.85 μg/L时准确度最高，假阳性率相对于0.65 μg/L或0.75 μg/L时明显减少，而诊断AIDS合并TM血症的灵敏度下降却不明显，达到了最佳的实验诊断性能。

综上所述，血清GM检测可作为AIDS合并TM血症的1项早期辅助性诊断指标，但灵敏度、阳性预测值低下,且存在较高的假阳性率，总准确度不高,因此，应结合或寻找其他指标进行快速诊断。针对AIDS合并TM血症，如何提高GM试验的灵敏度和降低假阳性率，给临床和实验室更多的启示，依然是关注的热点；同时，寻找一种灵敏度高和特异性强的可检测AIDS患者血中TM特异性抗原的单克隆抗体的ELISA已成为必要。