气相液氮罐内温度差异对脐带血造血干细胞保存质量的影响

富浩轩 付华来 王捷 邓刚

自1974年脐带血中被发现含有丰富的造血干细胞以来，有关学者对其进行了深入的研究，1988年世界上第一次使用脐带血造血干细胞移植治疗范可尼贫血获得成功[1，2]，引起了越来越多的专家及学者的重视。此后，脐带血造血干细胞的冷冻及长时间保存被广泛关注，并已有了一套相对成熟的保存方式。液氮的物理温度为-196 ℃，将脐带血造血干细胞直接浸没在液氮中保存能够最大限度地保持干细胞的活性，同时液氮因性质稳定、价格低廉等特点被广泛使用。

一份脐带血造血干细胞在合格冻存前需要进行相关的细菌及病毒检测，检测周期约为7 d左右。在此之前，各个未知检测结果的脐带血造血干细胞保存于同一液氮中。有报道指出，液氮可以像常见的液体（流水）一样，可将病毒和细菌在保存的容器内传播，例如：1976年THOMAS SCHAEFER[3]等人在液氮中发现了感染性病毒，提出了保存在液氮中的标本存在交叉污染的风险，且已被证实一些微生物可以在深低温环境下冻存并污染其他标本[4]。在随后的1995年，TEDDER[5]报告了从未感染过乙肝病毒的供者身上采集的骨髓干细胞，由于储存在液氮中而被乙型肝炎病毒污染，并导致接受该份骨髓干细胞的受者发生HBV感染的案例。这表明保存在液氮中的标本间存在交叉污染的风险，因此需要一种更优的保存标本的方式。

现在有一种气相液氮罐，其原理是利用低温的液氮蒸汽对液氮罐内环境进行降温达到一个近似于液氮温度的深低温环境，从而实现液氮与标本的干湿分离而采取的一种保存方式。理论上来说，在低于-79 ℃的环境中酶的生物活性处于基本停止状态，而在-196 ℃的环境中细胞的新陈代谢作用也处于基本停止状态，此时的细胞是可以长期保存的[6]。而实际情况是气相液氮罐由于受保温工艺的限制，液氮罐内液氮面以外位置的实际温度达不到-196 ℃。本文将探究这种气相液氮罐内不同位置的温度是否符合要求，以及保存在不同的温度下脐带血造血干细胞的冻存质量是否有差异。

材料与方法

1 脐带血样本 脐带血样本来自于浙江省脐带血造血干细胞库合法采集的捐献脐带血。所有捐献者均被充分告知其捐献脐带血的用途，填写健康调查表并签署知情同意书。样本总数为60份，分成3组。其中A组的20份脐带血造血干细胞保存于液氮中，作为对照组。B组的20份脐带血造血干细胞保存于气相液氮罐内温度最低处、C组的20份脐带血造血干细胞保存于气相液氮罐内温度最高处，B组和C组为实验组。选取的60份标本均采自2018年6月～10月，在浙江省内多家医院采集并通过相同的条件进行运输、制备、检测及程控降温冻存的脐带血造血干细胞，脐带血采集完毕后均在24 h内完成制备冻存，其过程均符合浙江省脐带血造血干细胞库质量控制要求。分别在冷冻前及冷冻2年后，进行有核细胞计数、CD34+细胞计数、有核细胞活性及CFU-GM培养等检测（冷冻后的检测结果来源于该份脐带血参照留样标本临床应用前的检测数据）。

2 实验仪器 XN-1000血细胞计数仪购自日本Sysmex公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司，SANYO MCO-20AIC CO2培养箱购自美国ThermoFisher公司，1892P-190AF-GB液氮罐购自美国MVE公司，CU-600恒温水浴箱购自上海一恒公司，7451程控降温仪购自美国Thermo Fisher公司。

3 实验试剂 WNR染液、WNR溶血素、WDF染液、WDF溶血素、SLS溶血素、DCL稀释液等计数仪相关试剂均购自日本Sysmex公司，单克隆抗体CD45-FITC、单克隆抗体CD34-PE、小鼠IgG1-PE、7-AAD、溶血素等流式仪相关试剂均购自美国BD公司，甲基纤维素培养基购自加拿大StemCell公司，RPMI-1640培养液购自美国GIBCO公司。

4 方法

4.1 有核细胞计数：利用WNR染液（Fluorocell WNR）对脐带血样本进行荧光染色并通过流式细胞术的方法对样本中所有血细胞进行检测，根据侧向荧光（SFL）和前向散射光（FSC）的强弱读取单位标本量中所含有核细胞数量从而计算得出样本中有核细胞的浓度。

4.2 CD34+%和有核细胞活性检测：根据ISHAGE（International Society for Hematotherapy and Graft Engineering）标准，利用CD45及CD34单克隆抗体对脐带血标本进行室温避光孵育标记，再通过流式细胞仪进行检测分析。根据造血干祖细胞的特征：1.CD45弱阳性；2.CD34阳性；3.低侧向散射光（SSC）；4.前向散射光（FSC）与淋巴细胞相似，圈选出造血干祖细胞在有核细胞中所占的比例。有核细胞活性的检测则是利用7-AAD染液对有核细胞进行染色后通过流式细胞仪分析测定，根据7-AAD结果阴性为活细胞，7-AAD结果阳性为死细胞，圈选出活细胞在有核细胞中所占的比例。

4.3 CFU-GM培养：通过将单位数量的有核细胞接种到半固体甲基纤维素培养基后在CO2培养箱中进行一定周期培养，正常的造血干祖细胞具有增殖分化能力并最终成为成熟的血细胞集落。通过计数培养孔内生长的集落数，推断该份脐带血造血干细胞的造血能力。理论上来说，培养板上生长的集落数占接种有核细胞数的比例应与CD34+%一致，但受细胞活性等因素影响，实际生长的集落数量无法达到理论值，因此可以通过集落的生长情况侧面反映出一份脐带血造血干细胞的质量。

5 统计学处理 应用SPSS22.0软件进行统计学分析，实验数据用平均数±标准差（±s）表示，多组均数比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 气相液氮罐内不同位置的温度 由于本实验使用的液氮罐是利用液氮气化后的深低温氮气进行标本保存，因此保存温度是无法达到-196 ℃的，测量结果见表1。

表1 气相液氮罐内不同位置的温度

由此可知距离液氮平面越远温度越高，而该气相液氮罐内距离液氮平面最远和最近位置的温度分别为：-188 ℃和-195 ℃。保存的标本则是从下到上放置在标本架上并垂直放置于-195℃～-188℃，距离液氮平面越近的脐带血造血干细胞所处的温度将越接近理想的保存温度（-196 ℃），反之则越远。

2 60份脐血造血干细胞冷冻前后的冻存质量分析按照浙江省脐带血造血干细胞库的标准操作规程分别对A组、B组、C组共60份脐带血进行造血干细胞的提取和冻存；分别对冷冻前及解冻后脐带血造血干细胞质量参数进行检测和计算：①有核细胞回收率：（解冻后有核细胞数/冷冻前有核细胞数）×100%；②活性变化率：[（冷冻前细胞活性-解冻后细胞活性）/冷冻前细胞活性]×100%；③集落回收率：（解冻后集落数/冷冻前集落数）×100%；④CD34+细胞回收率：（解冻后CD34+细胞%/冷冻前CD34+细胞%）×100%。

在对实验数据进行汇总整理后可以发现用于检测A、B、C三组代表标本冻存质量的项目（有核细胞回收率，活性变化率，集落回收率以及CD34+细胞回收率）其F值分别为0.982、0.828、1.573、0.859，P值均大于0.05，说明各组均值差异不具有统计学意义。结果详见表2。提示因保存标本的位置不同造成的略高于液氮温度的环境并没有对脐带血造血干细胞的保存质量产生影响。

3 样本冷冻前与复苏后检测结果对比 通过对各项检测结果的图谱进行比对，图1为利用血细胞计数仪对样本进行白细胞五分类计数的对比情况，由图1可知细胞分类并未见明显异常。图2为流式细胞仪检测样本CD34+以及有核细胞活性的对比情况，图2中未见明显区别。图3为样本CFU-GM集落培养情况对比，如图3所示各细胞集落生长情况正常。

表2 各组脐带血造血干细胞冻存质量参数比较

图1 有核细胞计数

讨 论

《脐带血造血干细胞库技术规范》规定：脐带血冷冻保存温度不高于-135℃，AABB（美国血库协会）要求：脐带血冷冻保存温度不高于-150℃，我们使用的气相罐内最高温度约为-188℃，高于以上标准，符合要求。同时由结果可知：保存在液相和气相中的脐带血造血干细胞的冻存质量没有差异，这表明：气相液氮罐内保存脐带血能够达到与在液氮中保存相同的效果，相对于传统的浸没在液氮中的保存而言，气相保存方式减少了在标本存取时产生液氮迸溅的可能，对操作人员更加的安全；同时还能避免因液氮的介质作用而造成标本间的交叉污染。

图2 CD34+及有核细胞活性

图3 CFU-GM培养结果

通过本次研究还表明：在低于-188℃的温度范围内，保存于气相罐内不同位置脐带血的冻存质量也无差异，这也为脐带血的冻存方式和质量管理提供了重要的数据支持。

本研究还值得进一步深入探索，由于长期在液氮中冻存的脐带血造血干细胞样本的质量已被证实不会存在差异[7]，而本研究所使用的冷冻样本均是冻存时间未超过两年的，通过实验结果可知：在这个时期内，保存于气相罐内不同位置脐带血的冻存质量无差异，但随着时间的延长，其保存效果是否仍无差异，需要我们做一个长期的观察和统计。另外，在液氮罐的气相环境中，是否可以真正避免标本间的交叉污染还需要继续通过实验进一步验证。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突