碳纤维-纳米金复合材料修饰电极检测ATP的研究

张思月，邵 波，谢 慧，胡亚晨，张冰雪，张晓萍，孙 伟

（海南师范大学 化学与化工学院，海南省激光技术与光电功能材料重点实验室，海口市功能材料与光电化学重点实验室，海南 海口 571158）

三磷酸腺苷（ATP）是黄嘌呤核苷酸用生物发酵的方法制备而成的化合物，是体内组织细胞所有生命活动的直接能量来源，被称为细胞内能量的“分子货币”。ATP作为生物的重要指标量被广泛用于临床医学和微生物学测定[1]、食品质量控制和环境分析等。目前，检测ATP含量的方法主要有高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法、光学分析法、生物发光法[3-4]及电化学方法[5-7]。而电化学方法由于灵敏度高、仪器简单等优点受到了广泛的关注。

纳米金制备方法简单，稳定性好，催化活性强，生物相容性好[8-10]，可高效吸附蛋白质且不影响被吸附蛋白质的生物活性，常常被用作探针对细胞内外的蛋白质、多肽链、多糖等生物体内常见大分子进行精确的定位。纳米金的电催化活性与其形态、粒径和分散度紧密相关。为了提高其电化学性能，通常利用其他载体（如纳米碳材料、石墨烯和金属氧化物）负载。纳米碳纤维（CNF）一般呈纤维网状结构，具有大的比表面积，可为纳米金粒子提供巨大的附着位点。目前CNF常用的制备方法有化学气相沉积法、电弧法、激光烧蚀法和前驱体法等[11]，而静电纺丝法与其他方法相比，因其原理简单，可操作性强，成本低，成为制备CNF最有前途的方法之一[12-14]。

本文采用静电纺丝法、高温碳化法和水热合成法制备了CNF-Au/CILE 电极，在最优实验条件下将该修饰电极用于ATP的检测，结果发现ATP浓度为0.06～0.80 mmol/L和12.0～150.0 mmol/L时，氧化峰电流值与浓度呈现出良好的线性关系，检测限为0.023 mmol/L。该电极具有良好的选择性和稳定性，并成功应用于三磷酸腺苷二钠注射液中ATP含量的测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CHI604E 电化学工作站，上海辰华仪器有限公司；三电极系统：CNF-Au/CILE 为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极；JSM-7100F型扫描电子显微镜（SEM），日本JEOL公司。

石墨粉，上海华谊集团华原化工有限公司胶体化工厂；N-己基吡啶六氟磷酸盐，兰州雨陆精细化工有限公司；5-三磷酸腺苷二钠，美国Kayon公司；0.2 mol/L B-R缓冲液，自制。所用试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 CNF-Au/CILE修饰电极的制备

采用水热合成法制备CNF-Au，配制1.5 mg/mL的CNF-Au分散液，取10µL均匀涂布于碳离子液体电极（CILE）上，晾干后得到CNF-Au/CILE修饰电极。

2 结果与讨论

2.1 CNF-Au/CILE电极的表征

图1是不同放大倍数下CNF-Au的SEM图，碳纤维呈现相互交错的网状结构，具有较大的比表面积，为金纳米粒子提供了充足的附着位点，使更多的金纳米粒子得以均匀地分布在碳纤维素表面。图2（A）是CILE和CNF-Au/CILE在1.0 mmol/L K3[Fe（CN）6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的循环伏安曲线图，在CNF-Au/CILE（曲线a）上的氧化还原峰电流相比于CILE（曲线b）的氧化还原峰电流明显增大，这是由于CNF-Au的存在增大了K3[Fe(CN)6]的电子转移速率，表明CNF-Au纳米复合材料具有良好的导电性。

图1 不同放大倍数下CNF-Au的SEM图Figure 1 SEM images of CNF-Au at different amplification multiples

图2（B）采用循环伏安法研究了CNF-Au/CILE的氧化还原峰电流值与扫描速度（υ）的关系，如图2（B）所示，在0.01～0.20 V/s 的扫速范围内，氧化还原峰电流与υ1/2呈线性关系，回归方程为Ipc（µA）=112.68υ1/2-7.08（n=10，γ=0.998）和Ipa（µA）=-84.79υ1/2-2.30（n=10，γ=0.998）。CNF-Au/CILE的有效面积可由Ran⁃dles-Sevcik方程（Ip=2.69×105AD1/2n3/2υ1/2C）[15-16]求解，其中，n是电子的转移数，A是电极的有效面积（cm2），D是铁氰化钾的扩散系数（7.6×10-6cm2/s），C是铁氰化钾的浓度（1.0 mmol/L），υ是电位扫描速度（V/s），按此公式求出CNF-Au/CILE的有效面积为0.015 2 cm2。

图2 （A）CILE和CNF-Au/CILE在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的循环伏安曲线图（v=100 mV/s）；（B）CNF-Au/CILE在含有1.0 mmol/LK3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中不同扫速下的循环伏安图（从a到i为0.01～0.20 V/s）Figure 2 (A)Cyclic voltammogram of CILE and CNF-Au/CILE in 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]and 0.1 mol/L KCl mixed solution(v=100 mV/s);(B)Cyclic voltammograms of CNF-Au/CILE at different scan rates(from a to i as 0.01～0.20 v/s)in 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]and 0.1 mol/L KCl mixed solution

2.2 ATP在CNF-Au/CILE上的电化学行为

图3（A）为CNF-Au/CILE（曲线a）和CILE（曲线b）在pH=2.0的B-R缓冲液中的循环伏安曲线，图3（B）为CNF-Au/CILE（曲线a）和CILE（曲线b）在含有1.0 mmol/L ATP、pH=2.0的B-R缓冲液中的循环伏安曲线。图3（B）中曲线b的氧化峰电位Epa为1.511 V，峰电流Ipa为63.05µA；曲线a的氧化峰电位Epa为1.536 V，峰电流Ipa为138.89µA。由实验数据可以看出，CNF-Au/CILE 的背景电流较CILE 大，说明纳米材料的存在使界面电容电流的增加；ATP在CNF-Au/CILE 的氧化峰电流较CILE有较大提高，说明CNF-Au的存在有利于提高电化学信号。

图3 （A）CILE（b）和CNF-Au/CILE（a）在pH=2.0 的B-R缓冲液中的循环伏安曲线;（B）1.0 mmol/L ATP在CILE（b）和CNF-Au/CILE（a）上的循环伏安曲线Figure 3 (A)Cyclic voltammograms of CNF-Au/CILE(a)and CILE(b)in blank B-R buffer solution with pH=2.0;(B)Cyclic voltammograms of 1.0 mmol/L ATP on CNF-Au/CILE(a)and CILE(b)

2.3 pH的影响

在pH 2.0～6.0的B-R 缓冲溶液中考察了pH值对ATP 电化学信号的影响，结果如图4所示，随着pH值的增加，在CNF-Au/CILE上测得的ATP氧化峰电流逐渐减小，最大值出现在pH=2.0。在pH=2.0的B-R缓冲溶液中进一步研究了ATP 的氧化峰电位与B-R 缓冲溶液pH 值的关系，线性回归方程为Epa（V）=-0.052 pH+1.63（n=5，γ=0.998），斜率为-0.052 V/pH，与理论值-0.059 V/pH 相接近。考察了富集电位和富集时间与ATP氧化峰电流值的关系。实验结果得出富集电位的值取+0.3 V、富集时间的值取80 s时ATP的氧化峰电流值达到最大值。因此，本实验均在富集电位为+0.3 V、富集时间为80 s条件下进行。

图4 1.0 mmol/L ATP在不同pH的B-R缓冲溶液中的循环伏安曲线Figure 4 Cyclic voltammograms of 1.0 mmol/L ATP in B-R buffer solution with different pH values

2.4 工作曲线

对不同浓度的ATP溶液分别进行DPV扫描，结果如图5所示，随着ATP浓度的增大，DPV氧化峰电流Ipa也逐渐增大。在ATP 浓度为0.06～0.80 mmol/L 时，氧化峰电流Ipa与ATP 浓度呈线性关系（图6-A），线性回归方程为Ipa（µA）=0.019 67C（µmol/L）+1.132（n=7，γ=0.988）；在ATP浓度为12.0～150.0 mmol/L时，氧化峰电流Ipa与ATP 浓度呈线性关系（图6-B），线性回归方程为Ipa（µA）=0.450C（mmol/L）+12.889（n=8，γ=0.997），检测限为0.023 mmol/L。

图5 CNF-Au/CILE随着不同浓度ATP加入后的DPV叠加图Figure 5 Differential pulse voltammograms of CNF-Au/CILE with different concentration of ATP

图6 氧化峰电流与ATP浓度的线性关系Figure 6 The linear relationship between Ipa and the.concentration of ATP

2.5 干扰测定

考察了一系列常见干扰物质（L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-天冬酸、Ba2+、Ca2+、K+）对ATP测定的影响，实验结果如表1所示。常见的共存干扰物质对ATP测定的影响都不大，说明CNF-Au/CILE测定ATP具有一定的抗干扰能力。

表1 共存物对0.5 mmol/L ATP测定的影响Table 1 Effects of coexisting substances on determination of 0.5 mmol/L ATP

2.6 分析应用

采用标准曲线法和标准加入法测定了样品的含量、回收率和相对标准偏差（RSD），结果如表2所示。由表2可知，实际检测取得了良好的效果。

表2 三磷酸腺苷二钠注射液样品的测定结果（n = 3）Table 2 Determination of adenosine triphosphate disodium injection sample（n = 3）

3 结论

以金纳米粒子为电催化活性剂，纳米碳纤维为载体，采用水热合成法制备碳纤维-金复合材料，将最优浓度的碳纤维-金复合材料分散液滴涂于碳离子液体电极的表面，自然晾干后制得了碳纤维-金修饰电极（CNF-Au/CILE），计算得到有效面积为1.52×10-2cm2。采用CNF-Au/CILE 做了ATP的电化学测试，在最优实验条件（碳纤维-金复合材料分散液浓度为1.5 mg/mL，B-R富集时间为80 s，富集电位为+0.3 V，缓冲溶液的pH=2）下，ATP浓度为0.06～0.80 mmol/L和12.0～150.0 mmol/L时，氧化峰电流值与浓度呈现出良好的线性关系，ATP的检测限为0.023 mmol/L。一系列常见干扰物质对ATP测定的影响较小，将该实验方法应用于三磷酸腺苷二钠注射液中ATP含量的测定取得了良好的效果。