褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆幼苗生长及生理特性的影响

孙浩月，吴洪斌，李 明，张 琦，韩毅强，杜吉到

（1.黑龙江八一农垦大学 农学院，黑龙江 大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆163319）

芸豆学名菜豆（Phaseoluse vulgarisL.），又称四季豆，属豆科菜豆属1 年生草本植物。芸豆是我国重要的出口小宗粮豆作物，同时也是黑龙江省种植面积最大的豆类作物之一[1]。芸豆营养丰富，具有良好的保健功能，深受大众喜爱。

土壤盐渍化是主要的非生物胁迫之一，NaCl 是土壤中最常见、分布最广泛的盐分[2]，同时盐胁迫对不同的植物个体或个体的不同发育阶段的影响效果不同，处于同一生长发育阶段的个体对盐胁迫作出的反应也不尽相同[3-4]。盐胁迫对植物生长的危害主要体现在抑制种子萌发和生长发育、影响开花周期、降低结实率等方面。此外，盐胁迫还会导致植物体内产生大量活性氧来应对胁迫，大量活性氧给植物带来了更严重的伤害。为了使植物适应盐碱胁迫环境，在胁迫条件下更好地生长发育，一般采用种子处理、施用外源化合物和选育耐盐品种3类方法来提高植物的盐耐受能力。施用外源化合物通常是以浸种和种植后施用无机物或生长调节剂等2 种方式，提高植物体内必需元素和微量元素的含量，以提高抗氧化酶活性，维持细胞膜透性和离子平衡，从而缓解盐胁迫对植物的伤害，提高植物的耐盐性。

植物生长调节剂能够有效地“掌控”植物的生长和增强其抗逆性[5]。褪黑素是一种新兴的调节剂，最初发现于维管植物中，具有多种功能，如可保护叶绿素、调节植物光周期，有类似于生长素（IAA）的结构和功能[6]，具有在组织内自由移动、直接清除自由基、对光照敏感等特性[7-8]，可以影响多种代谢途径进而提高真菌和高等植物对环境的耐受性[7，9-11]。研究发现，褪黑素是一种在植物体内含量微少并极其不稳定的小分子物质，却在生理调节、增强植物抗逆性方面起着非常重要的作用[10-12]。有研究表明，外源褪黑素可有效缓解盐胁迫所带来的氧化损伤，其中可有效激活抗氧化酶系统，帮助植物抵御盐胁迫逆境[13]。李红杰[14]研究表明，外源褪黑素可有效缓解盐胁迫对芹菜幼苗生长发育的影响。其类似的效应还在棉花[15]、番茄[16]、苜蓿[17]等多种作物上有所体现。芸豆耐盐性较弱，土壤盐化将对芸豆的生产力及其营养品质造成较大影响[18]，从而制约我国东北地区特别是黑龙江省和内蒙古地区芸豆播种面积和产量的进一步提高，因此，选育耐盐芸豆品种并探究其响应盐胁迫的作用机制显得尤为重要[19]。鉴于此，以ZX-YD-008 为供试品种，研究褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆幼苗生长及生理特性的影响，为褪黑素应用到芸豆抗逆研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料和设计

供试材料为芸豆ZX-YD-008，由国家杂粮工程技术研究中心提供，处理编号为R。试验用NaCl 和褪黑素均为分析纯，购自Sigma 试剂公司。以预备试验确定NaCl 处理质量分数为0.4%，褪黑素处理浓度为0.1 mmol/L。

试验于2020 年在黑龙江八一农垦大学农学院大创实验室进行。将均匀一致的种子用10%次氯酸钠消毒5 min 后，蒸馏水冲洗干净，并用无菌滤纸吸干种子表面水分备用。将种子分为2 份，分别浸泡在蒸馏水和0.1 mmol/L 褪黑素溶液中进行预处理，浸种时间为24 h，然后将种子摆放在装有草炭土、蛭石（体积比3∶1）的盆钵中，按土壤干质量配制成NaCl 质量分数为0.4%的模拟盐土环境。播种前保持土壤潮湿，以手捏成团、指尖不出浆、松手后不松散为宜，同时以蒸馏水拌土作为对照，每盆6 株。试验共设置4 个处理，分别是蒸馏水浸种+0.4%NaCl 拌土（SR）、褪黑素浸种+蒸馏水拌土（MWR）、褪黑素浸种+0.4% NaCl 拌土（MSR）、蒸馏水浸种+蒸馏水拌土（WR，对照组），3 次重复，每重复5 盆，随机区组排列。为保证盐浓度不变和水分正常供应，根据土壤含水量始终保持田间持水量的80%，每天喷施0.1 mmol/L 褪黑素或者蒸馏水。植株初生真叶完全展开后5、10、15 d，进行形态指标、光合指标及叶绿素荧光参数的测定，并取样保存于-80 ℃冰箱，用于后期生理指标的测定。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生长指标的测定 植株初生真叶完全展开后每5 d 测定一次，共测定3 次。每处理选取3 株长势中等的幼苗，采用刻度尺测定株高，按部位将地上部和地下部分开，并用蒸馏水冲洗干净，吸干表面水分，采用万分之一天平称取各部分鲜质量，然后各部分于105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干至恒定质量，得出地上部及地下部干物质质量。

1.2.2 气体交换参数的测定 于取样当天9:00—11：00 采 用 光 合 仪（Li-6400，Li-Cor，Huntington Beach，CA，USA）进行测定，每处理取3 株。测定指标包括植株叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2浓度（Ci）。测定时光强设为1 000 μmol/（m2·s），叶片温度25 ℃，参比室CO2浓度400 μmol/mol。

1.2.3 叶绿素荧光参数的测定 选取完全展开的叶片，采用多功能植物测量仪Multispe Q 测定叶绿素荧光参数。包括PS Ⅱ的实际光合量子产量（ΦPSⅡ）、非调节性能量耗散的量子产量（ΦNO）、调节性能量耗散的量子产量（ΦNPQ）、非光化学淬灭系数（NPQ），分别取3次数据的平均值进行分析。

1.2.4 光合色素的测定 采用乙醇浸提法测定光合色素含量[20]，称取0.1 g 新鲜叶片，剪碎，置于盛有10 mL 95%乙醇提取液的试管中，封口后置于室温暗处浸提至叶片组织完全变白，利用分光光度计将浸提液在665、649、470 nm 的波长下进行比色，并计算光合色素含量，每个处理重复3次。

1.2.5 抗氧化酶活性的测定 采用氮蓝四唑（NBT）光化学还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[21]，愈创木酚显色法测定过氧化物酶（POD）活性[21]，H2O2氧化还原法测定过氧化氢酶（CAT）活性[22]。

1.2.6 渗透调节物质和膜脂过氧化水平的测定

采用酸性茚三酮比色法测定游离脯氨酸含量[23]，考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量[24]，蒽酮比色法测定可溶性糖含量[25]，硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量；参照张以顺[26]的方法用电导 率 仪（DDS-309C，ARK Instruments，Chengdu，China）测量叶片相对电导率。

1.3 数据分析

利用SPSS 19.0 软件进行方差分析，采用Microsoft Excel 2010软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆叶片光合特性的影响

由图1 可知，与对照相比，盐胁迫降低了Pn、Gs、Tr，且随胁迫时间的延长，Pn、Gs、Tr 呈不断下降趋 势，5～15 d 分 别 降 低17.5%～63.8%、13.6%～76.4%、47.5%～72.3%，而盐胁迫下Ci 显著增加且呈缓慢上升趋势；MSR 处理较SR 处理可明显提高叶片的Pn、Gs、Tr，分别为7.4%～11.5%、9.3%～20.0%、2.7%～31.3%，Ci 则降低2.4%～9.5%；与对照相比，MSR 处理显著降低Pn、Gs、Tr，5～15 d 其分别降低11.4%～60.4%、5.6%～71.6%、41.0%～63.7%，而Ci 提高11.1%～53.7%。

2.2 褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆叶片叶绿素荧光的影响

由图2 可知，与对照相比，盐胁迫降低ΦPSⅡ和ΦNPQ，5～15 d 其分别降低9.9%～16.6%、2.2%～7.7%，而ΦNO、NPQ 分别提高30.8%～49.1%、4.0%～83.2%；MWR处理与对照相比，ΦPSⅡ随胁迫时间延长呈下降趋势，但10 d 时ΦPSⅡ高于对照但无明显差异，而ΦNO、NPQ、ΦNPQ呈缓慢上升趋势，但其中15 d 的ΦNO以及10 d 的ΦNPQ均低于对照；与SR 处理相比，MSR处理下ΦPSⅡ、ΦNPQ在5～15 d 分别提高2.7%～11.7%、1.6%～3.8%，而ΦNO降低8.9%～15.0%，NPQ 在5、10 d分别降低20.4%、29.2%，而15 d 时提高13.3%；与对照相比，MSR 处理下ΦPSⅡ、ΦNPQ在5～15 d 分别降低6.8%～11.6%、4.2%～5.0%，ΦNO、NPQ 分别提高7.7%～16.7%、16.5%～54.9%。

2.3 褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆叶片光合色素含量的影响

由图3可知，与对照相比，盐胁迫下光合色素含量均有所降低，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b 含量在5～15 d 分别减少8.4%～18.7%、1.0%～9.1%、7.8%～16.0%，但叶绿素a/b 值无显著变化；MWR 处理的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b 含量在5 d 时均高于对照，在10、15 d时，除叶绿素b含量外，叶绿素a、叶绿素a+b含量均低于对照；MSR 处理较SR处理提高叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b 含量，分别增加5.9%～7.8%、0.9%～2.7%、4.4%～6.3%，而叶绿素a/b 值增加3.6%～5.1%；与对照相比，MSR处理抑制叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b 含量的增长，其在5～15 d 分别降低2.5%～13.3%、0.2%～6.7%、3.2%～10.7%，而叶绿素a/b值在10、15 d分别降低4.9%、5.9%。

2.4 褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆叶片抗氧化酶活性的影响

由图4 可知，与对照相比，盐胁迫增加SOD、POD、CAT 活性，在5～15 d 分别增加37.0%～84.0%、13.1%～90.4%、26.6%～62.0%；MWR 处理其活性均有不同程度的增加，但其中SOD、POD 活性在15 d时略低于对照，分别降低4.6%、16.1%；MSR 处理的芸豆叶片SOD、POD、CAT活性在整个处理阶段均高于SR 处理，在5～15 d 分别增加7.1%～15.3%、2.1%～206.5%、14.4%～27.1%；MSR 处理与对照相比，SOD、POD、CAT 活性分别增加46.8%～112.2%、15.4%～259.4%、57.1%～105.9%。

2.5 褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆叶片渗透调节物质含量和膜脂过氧化的影响

由图5 可知，与对照相比，盐胁迫增加了脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，但其中可溶性蛋白含量在15 d 较对照显著降低25.1%，而脯氨酸和可溶性糖含量在5～15 d 分别提高32.8%～158.5%、24.2%～112.8%；与对照相比，除15 d 可溶性蛋白含量外，MWR 处理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于对照；MSR 处理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量在5～15 d 均高于SR 处理，其中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量分别提高4.3%～14.4%、8.0%～89.4%、8.9%～30.7%。

与对照相比，SR、MWR 和MSR 处理均提高了MDA 含量和相对电导率，但其增长幅度不同，且MWR 处理的相对电导率在15 d 时与对照相比无显著变化。5 d 的MDA 含量在SR、MWR、MSR 处理中分别提高106.5%、54.2%、75.8%，10 d 分别提高123.9%、41.1%、75.9%，15 d 分 别 提 高173.7%、52.6%、56.4%；而5 d 的相对电导率在SR、MWR、MSR 处理中分别提高54.7%、19.3%、27.8%，10 d 分别 提 高123.1%、40.0%、65.6%，15 d 分 别 提 高23.6%、0.4%、17.0%。MSR 处理与SR 处理相比，显著降低MDA 含量和相对电导率，但仍均高于对照，其 中MDA 含 量 在5、10、15 d 分 别 降 低14.9%、21.4%、42.8%，相对电导率分别降低17.4%、25.8%、5.3%。

2.6 褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆植株生物量的影响

由表1 可知，盐胁迫抑制了芸豆幼苗的正常生长，其株高显著低于对照，且随胁迫时间延长抑制作用明显。MWR 处理与对照相比，株高略低但变化不大；与SR 处理相比，MSR 处理的株高在5～15 d增加3.1%～8.1%，而MSR 处理与对照相比降低10.5%～11.8%。

表1 不同处理的芸豆生长和干物质积累情况Tab.1 Growth and dry matter accumulation of kidney bean with different treatments

与对照相比，盐胁迫降低了芸豆幼苗的地上部和地下部的鲜质量与干质量，且随胁迫时间延长抑制作用明显，其中地上部和地下部鲜质量在5～15 d分别降低23.8%～35.5%、32.9%～37.5%，地上部和地下部干质量分别降低19.4%～23.5%、25.0%～28.8%；褪黑素浸种可以有效缓解盐胁迫对芸豆幼苗生长的影响，与SR 处理相比，MSR 处理的地上部、地下部鲜质量在5～15 d 分别提高6.3%～13.9%、9.1%～18.8%，地上部、地下部干质量分别提高8.1%～9.7%、11.9%～16.7%，而MSR 处理与对照相比，芸豆幼苗的地上部、地下部鲜质量分别降低15.8%～26.6%、25.8%～26.8%，地上部、地下部干质量分别降低13.0%～16.0%、12.5%～20.3%。

3 结论与讨论

盐害是限制农作物产量的主要环境因子[27-29]。株高和生物量是衡量逆境胁迫下植物生长发育的关键指标。前人研究表明，褪黑素可以明显缓解盐胁迫对棉花[15]、番茄[16]、大豆[30]、水稻[8]等危害，促进植株生长。本研究结果表明，褪黑素浸种明显提高了株高、地上部及地下部干鲜质量，与前人研究结果一致。其原因可能是褪黑素浸种提高了盐胁迫下芸豆叶片的同化力和光合速率，从而提高水分利用率，利于芸豆幼苗的生长和生物量的积累。

光合作用是植物利用光能驱动有机化合物合成的物理化学过程，是植物生产的基础[31]。植物叶片光系统平衡光能吸收和CO2同化[32]，盐胁迫影响类囊体膜的电子传递、碳的同化和水气交换等光合过程。前人研究表明，褪黑素的抗氧化能力能防止叶绿素降解，提高光系统Ⅱ的效率[33]。在本试验中，褪黑素浸种提高了光合色素含量，同时提高了叶片的叶绿素a/b 值，提高了光能利用率，表明褪黑素浸种能够改善叶片的光能分配，使更多的光能用于碳固定[33-34]。植物在盐胁迫中的一个重要响应是通过关闭气孔以减少水分的流失，同时伴随着Pn、Tr、Gs下调。与此同时，在本试验中，褪黑素浸种可以缓解盐胁迫下Pn、Tr、Gs 的下降，同时降低了Ci，说明盐胁迫已损伤了光合系统，而褪黑素浸种对盐胁迫的光合活性下降具有缓解作用，能够提高盐胁迫下植物叶肉细胞的光合能力。

叶绿素荧光参数变化反映植物叶绿体PSⅠ和PSⅡ（主要是PSⅡ）的光能吸收利用、传递及耗散等诸多情况的灵敏探针[35]，逆境条件下引起卡尔文循环运行受阻时，会降低光化学反应对叶绿素吸收光能的利用，导致过剩激发能增加，而引起PSⅡ光抑制[36-37]，ΦPSⅡ、ΦNO、ΦNPQ、NPQ是反映植物叶片PSⅡ活性的重要指标，其ΦPSⅡ、ΦNO、ΦNPQ三者总和等于1[38-39]。本研究发现，褪黑素浸种可以有效缓解芸豆叶片ΦPSⅡ和ΦNPQ下降，与之相反，褪黑素浸种降低了ΦNO，说明芸豆幼苗通过自身保护性调控机制消耗掉过剩的光能而使PSⅡ反应中心受伤害的程度降至最低，实现植株的自我保护。这可能是通过褪黑素浸种缓解了芸豆幼苗PSⅡ受到的破坏程度，通过叶黄素循环、荧光发射、光呼吸等热耗散途径来消耗过剩光能从而缓解盐胁迫对光抑制的现象[40]。NPQ 表示PSⅡ天然色素吸收的光能中不能用于光合电子传递而以热的形式耗散的部分，是植物的一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用[41-42]。在本试验中，褪黑素浸种缓解了盐胁迫下NPQ的升高，从而减少光损伤并提高光能利用率。

当植物受到逆境胁迫时，植物体内会积累大量的活性氧，活性氧产生与清除机制的失衡会破损膜组织[43]，而使膜脂过氧化作用加剧。前人研究表明，盐胁迫提高了芦苇幼苗的SOD、POD、CAT 活性，喷施外源褪黑素后，SOD、POD、CAT 活性进一步显著升高[44]。王芳等[35]研究表明，与单独盐胁迫处理相比，添加褪黑素处理能够显著促进玉米幼苗的生长，其幼苗SOD、POD、CAT 活性分别增加13.45%、55.40%、295.86%。本试验研究表明，盐胁迫明显提高了芸豆叶片的活性，褪黑素浸种后盐胁迫下芸豆叶片的SOD、POD、CAT活性进一步明显提高。褪黑素通过提高抗氧化酶活性来降低非生物胁迫造成的活性氧积累，从而增强植物的抗逆能力[45]。与此同时，本试验表明，褪黑素浸种随着盐胁迫时间的延长芸豆叶片的SOD、POD 活性呈现缓慢升高的趋势，而CAT 活性呈现缓慢下降趋势，表明当植物体内活性氧的产生与清除处于一个植物自身可修复的范围时，就会诱导自身酶活性升高，而通过自身保护性酶系统进行调控，从而减轻植物损伤的程度。

当经受盐胁迫，植物体内会积累渗透调节物质来降低细胞的水势，加强植物保持水的能力，有效地减少因盐胁迫造成的损害[46]。前人研究表明，褪黑素会有效增加盐胁迫下大豆[4]、玉米[35]、菊花[47]、番茄[48]中的脯氨酸和可溶性蛋白等渗透调节物质含量，降低MDA含量和相对电导率。在本试验中也发现，与盐胁迫相比，褪黑素浸种增加了芸豆幼苗脯氨酸等渗透调节物质的含量，MDA 含量和相对电导率明显下降。说明褪黑素能够通过调节细胞渗透势，增强细胞代谢水平和渗透调节能力，保护膜结构的稳定性，从而减轻盐胁迫对芸豆幼苗的伤害。

综上所述，褪黑素浸种缓解了盐胁迫对芸豆幼苗的抑制作用，褪黑素通过提高光合色素含量和PSⅡ的光化学效率以及减缓光合器官的氧化损伤，进而缓解由盐胁迫造成的生物量降低。本试验结果表明，褪黑素浸种可以有效地增强芸豆幼苗在盐胁迫下的光合能力和抗氧化能力，本结果可以为提高植物耐盐性和盐碱地利用效率提供一定的参考和科学依据。