甘草外植体诱导愈伤组织形成条件优化

付 丽， 张东向， 刘丽杰， 刘安奇， 吕 晴， 李 伟

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院/抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

甘草(GlycurrihizauralensisFisch.)为多年生草本植物[1]，我国著名的大宗常用的中药材和轻化工原料，具有缓解止疼、清热解毒、抗癌、抗衰老等疗效[2]，国内、国际市场需求量巨大，甘草的用量远超过杜仲、金银花、人参、红花、元胡等中药材，缺了甘草，中药难以成方[3]。除制药[4-5]行业应用外，还应用在食品[6-8]、饮料[9]、烟草、化工、酿造、国防工业等行业[10]。当前，大量使用和过度开发使得野生甘草资源面临枯竭，甘草组织培养体系的建立，为保护甘草资源和进行新品种选育提供了新途径。

响应面分析法(response surface methodology，RSM)[11]，具有使用方便、试验周期短、回归方程精度高等优点[12]，利用多元二次回归方程，将多因子指标相互关系用多项式近似拟合[13]，建立关于因素与影响值的函数关系，可精确研究各因素之间的交互作用[14]。本实验利用植物组织培养技术，采用 Box-Behnken Design设计方法筛选诱导甘草愈伤组织的最适培养基，探究不同激素组合对甘草愈伤组织诱导的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2019年4月至2020年12月在齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物代谢生理研究室内进行。甘草种子购自黑龙江省甘草种植基地，经专家鉴定为甘草(GlycurrihizauralensisFisch.)的干燥成熟种子，保存于4 ℃冰箱中。

1.2 方 法

1.2.1甘草无菌苗的获得

选取干燥且饱满的甘草种子，经蒸馏水浸泡24 h，置于超净工作台上，用 0.1%升汞浸泡10 min，取出后用无菌水冲洗5～6次，每次30 s，再用无菌滤纸将种子表面的水吸干，接种到蔗糖为30 g·L-1的MS固体培养基上，封口后置于(25±1)℃恒温培养箱中培养，光照强度2 000 lx、光照条件12 h·d-1，待其生长至21 d时获得甘草无菌苗。

1.2.2甘草愈伤组织的诱导

取上述无菌苗作为外植体，在超净工作台上用灭过菌的镊子取出，置于事先经高压灭菌干燥冷却后的培养皿上，用灭过菌的解剖刀和镊子将幼茎切成约1 cm长，叶片切成0.5 cm2大小，接种到经121 ℃高压灭菌20 min后的不同激素处理的诱导培养基内，每瓶接种6个外植体，封口后放入恒温培养箱内培养，温度为25 ℃，光照2 000 lx，每种处理重复6次，培养30 d后统计愈伤组织形成情况，以“+”多少表示愈伤组织长势。

愈伤组织诱导率(%)=(长出愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数)×100%。

1)单因子试验

将上述幼茎、叶片接种到6-BA浓度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的MS诱导培养基上，研究不同6-BA浓度对甘草愈伤组织诱导的影响。

2)不同激素组合试验

不同6-BA、NAA、2,4-D组合试验设计见表1、表2。

表1 不同6-BA和NAA浓度组合试验设计

表2 不同2,4-D和6-BA浓度组合试验设计

3)响应面试验设计

以2,4-D、6-BA和NAA为单因素，每个因素取3水平，以愈伤组织诱导率为响应值，采用 Design-Expert 12 统计分析软件进行响应面设计实验，按照Box-Behnken 试验设计，对诱导愈伤组织的激素进行筛选，设计3因素3水平的响应面试验(表3)。

表3 Box-Behnken设计3因素3水平

1.3 统计学分析

采用Microsoft Excel 2010软件和Design-Expert 12软件进行数据计算和统计学分析。

2 实验结果与分析

2.1 不同6-BA浓度对甘草愈伤组织形成的影响

将甘草外植体接种在不同6-BA浓度的MS培养基上诱导愈伤组织。由表4可知，处理3愈伤组织诱导效果最好，愈伤组织生长状态良好，大部分呈淡黄色，且愈伤诱导率最高，为97.22%；处理2次之，愈伤诱导率为94.4%；处理1愈伤生长状态相对较差，诱导率最低，为72.22%。据此认为，在单独使用6-BA诱导甘草愈伤组织时，6-BA浓度为1.5 mg·L-1最有利于甘草愈伤组织的形成。

表4 不同6-BA浓度对甘草愈伤组织诱导的影响

2.2 不同6-BA和NAA浓度组合对愈伤组织形成的影响

将甘草外植体接种在不同6-BA和NAA浓度组合的MS培养基上诱导愈伤组织。由表5可知，处理3、4、5愈伤组织生长状态良好，诱导率均高于80%，其中处理4愈伤组织诱导效果最好，愈伤呈褐色数量最少，且愈伤诱导率最高，为97.22%；处理5次之，诱导率与处理4达到同一水平，愈伤组织长势良好，多数呈淡黄色；处理1、2愈伤生长状态虽相对较差，但有不定根生长；处理1愈伤组织长势最差，诱导率最低，为47.22%，且有许多褐色组织增生。据此认为，NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1最有利于甘草愈伤组织的形成。

表5 不同6-BA和NAA浓度组合对甘草愈伤组织形成的影响

2.3 不同2,4-D和6-BA浓度组合对愈伤组织形成的影响

将甘草外植体接种在不同2,4-D和6-BA浓度组合的MS培养基上诱导愈伤组织。由表6可知，所有处理愈伤组织诱导率均在80%以上，其中处理2愈伤组织诱导率最高，为97.22%，愈伤组织诱导效果较好，多数愈伤呈淡黄色；处理3愈伤组织诱导率为94.44%，且愈伤组织长势最好，并有不定芽生长，生芽率为6.89%；而处理5诱导率虽为80.56%，但愈伤生长状态相对较差。据此认为，6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 1.5 mg·L-1最有利于甘草愈伤组织的形成。

表6 不同2,4-D和6-BA浓度组合对甘草愈伤组织形成的影响

2.4 响应面分析法试验结果

不同激素组合对甘草外植体愈伤组织诱导的影响不同。根据Box-Behnken 试验设计，结合表7和表8可知，各处理组愈伤组织诱导率均高于75%，但有一定的褐变现象发生，褐化率2.50%～17.02%，处理2诱导率最高，达100%，长势有12.50%达“+++”，53.12%达“++”，褐化率为15.63%；其次处理1诱导率为97.23%，处理1愈伤组织长势比处理2长势较好，长势有16.38%达“+++”，53.19%达“++”，但其褐化率为17.02%，高于处理2；处理5、7愈伤组织诱导率分别为78.06%、79.41%，长势一般，无“+++”，且褐化率均高于8.5%；处理15愈伤组织诱导率最低，为75.29%，但愈伤长势比处理5、7长势好，且褐化率较低，为5.89%。

表7 不同激素组合对甘草愈伤组织诱导的影响

以2,4-D(A)、6-BA(B)、NAA(C)为影响因素，诱导率(Y)为响应值，利用 Design-Expert 12软件对表8数据进行统计分析，其回归方程的显著性检验及方差分析见表9。回归结果表明，一次项A、B、C，交互项BC以及二次项A 2、C 2对愈伤组织的诱导率的影响达极显著水平(p<0.01)，AC对实验结果的影响显著(p<0.05)，各因素对甘草愈伤组织诱导率的影响程度大小依次为2,4-D>NAA>6-BA。对试验数据进行二次多元拟合回归，得到回归预测模型为：Y=140.75+24.08 A-21.75 B-110.08 C+3.4 AB+9.18 AC+35.9 BC-10.28 A2-10.31 B2+28.32 C2。

表8 Box-Behnken 试验设计及结果

由表9可知，模型的回归F值为184.04，p<0.01，表明该回归极显著，模型对试验实际情况拟合较好。失拟项不显著(p>0.05)，相关系数r2=0.995 8，校正决定系数R=0.990 4，表明该模型与实际的试验拟合程度良好，误差小，模型选择合适，可以用该模型对响应值进行分析和预测来确定最佳诱导甘草愈伤组织的培养基配方，各因素对甘草愈伤组织诱导影响大小依次为2,4-D>NAA>6-BA。

表9 回归方程显著性检验及方差分析

根据回归方程，绘制不同激素组合与甘草愈伤组织诱导率的响应面分析图(图2)。通过 Design-Expert 12统计分析软件优化，获得诱导愈伤组织的培养基为 MS+2,4-D 1.44 mg·L-1+6-BA 1.18 mg·L-1+NAA 1.44 mg·L-1，预测甘草愈伤组织诱导率为100%。

为检测结果的可靠性，采用最佳诱导愈伤组织的培养基进行验证，结果表明，甘草愈伤组织诱导率为100%，愈伤长势良好，呈淡黄疏松状态，验证了预测结果的正确性，说明响应面分析法得到的激素质量浓度真实可靠。

3 结 论

愈伤组织诱导和分化是植物组织培养过程中的主要研究内容，利用植物外植体来诱导愈伤组织，首要任务是无菌苗的获取，常用的消毒剂有升汞[15]、次氯酸钠和75%乙醇。本实验选用0.1%升汞作为甘草种子消毒剂，成功获取甘草无菌苗。其次，调节植物生长调节剂的种类及配比是愈伤组织诱导的重要手段[16]，通常使用细胞分裂素和生长素组合。响应面分析法是近年来各领域学者常用的实验设计和优化方法[17-20]，张晶等[21]研究了响应面法优化艾蒿水提物的提取工艺；杨丽萍等[22]研究了响应面法优化红提果醋的发酵条件；陈兵兵等[23]进行了甘草中总黄酮和总多糖联合的提取工艺研究；而利用响应面法优化甘草愈伤组织诱导的研究较少。因此，在本实验中采用Box-Behnken方法设计响应面分析试验，以2,4-D、6-BA和NAA为单因素，设计3因素3水平的响应面试验得到多种激素组合，确定甘草愈伤组织的诱导培养基为 MS+2,4-D 1.44 mg·L-1+6-BA 1.18 mg·L-1+NAA 1.44 mg·L-1，并进行了验证，其诱导率可达100%，说明响应面分析法得到的激素质量浓度真实可靠。