基于ISSR标记的北苍术种质资源亲缘关系分析

姜雨昕， 肖春萍， 孙 金， 武艳雪， 翁丽丽

(长春中医药大学， 吉林 长春 130117)

ISSR即简单重复序列间分子标记，是基于SSR基础之上迅速发展起来的，并广泛应用于动植物居群遗传学研究的一项新型DNA分子标记技术[5]，其原理是用锚定的微卫星DNA作为引物，并在SSR序列的3′或者5′端加入2～4个随机核苷酸，对两侧具有反向排列SSR的DNA片段进行PCR扩增。ISSR技术具有操作简便、稳定性高、多态性丰富、试验成本低、信息量大、适用范围广等优点[6-7]。近年来ISSR技术在遗传多样性及亲缘性问题的研究中已广泛得到应用[8-10]。此项技术作为物种基因组多态性的分析，避免了环境与地理位置的限定，其多态性较高，获得的信息量多于RAPD(随机扩增多态性)DNA分子标记技术，精确程度可与RFLP(限制性片段长度多态性)技术相比较[11-12]。

北苍术(Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.)为菊科苍术属多年生草本植物，主产于我国吉林、辽宁、河北、内蒙古等地，以其干燥根茎入药，具有燥湿健脾、祛风散寒的功效，主要用于湿阻中焦、脘腹胀满、风寒感冒等症[1-2]，还具有抗菌抗炎、降血压、抗肿瘤及保肝利尿等多种药理作用[3-4]。苍术是健脾祛湿的常用药材，近几年成为国内外学者关注的热点品种[13]。近年来，为保护北苍术的野生资源及保障市场需求，对北苍术进行相应的引种栽培及杂交选育使苍术属植物种质资源越来越复杂，对北苍术资源亲缘关系进行分析，将为北苍术的起源、进化研究提供理论依据，也为北苍术资源的有效利用及保护提供理论支撑。中药材种子种苗作为中药材产业链的起点，其质量在中药材种植及GAP发展过程中发挥举足轻重的作用。鉴于此，采用ISSR标记技术对不同地区的22份北苍术种子进行遗传多样性及亲缘关系分析，以期为开展北苍术的分类、遗传与进化研究提供了分子学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北苍术种子2019年分别采自陕西、内蒙古、河北、辽宁、吉林等省区，均为人工栽培，采后晾干，除去杂质，4 ℃储藏备用。样品种质名称及来源见表1。

表1 种质信息

1.2 试验试剂与仪器

植物组织基因组DNA抽提试剂盒(生工生物)、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物)、TaqPlus DNA聚合酶(BBI)、琼脂糖B(BBI)、PCR反应扩增仪(BBI)、高速微量离心机(生工生物)、电泳仪(北京六一)、凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)、微量分光光度计(Merinton Instrument,Inc)、测序仪(ABI,Foster,CA,USA)、4S Red Plus核酸染色剂(BBI)、Gene Ruler DNA Ladder Mix(Thermo Scientific)。

1.3 试验方法

1.3.1基因组DNA的提取

每份样品取4～5粒饱满种子，采用试剂盒法提取样品DNA，操作方法参考该试剂盒说明书。采用电泳1.5%琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，110 V，100 mA，20 min，电泳观察DNA条带清晰明亮，无明显杂带，则说明DNA完整性较好。-20 ℃保存备用。

1.3.2引物和最佳退火温度的筛选

参照加拿大不列颠哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物序列，初筛出的25条引物由上海生工生物公司合成，选取不同地区种子序号1～5，进一步选取10条扩增条带多且清晰的引物用于后续PCR扩增。在PCR仪器上设置12个梯度做PCR摸索最理想的退火温度。

1.3.3ISSR-PCR反应体系和扩增程序

扩增体系20 μL的PCR反应液：10×PCR Buffer 2 μL，引物(50 pmol·μL-1)1 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μL，模板DNA(50 ng·μL-1)1 μL，超纯水补足至25.0 μL。

扩增程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，各不同退火温度1 min，72 ℃ 2 min，40个循环，72 ℃ 10 min。ISSR-PCR反应完成后，使用琼脂糖凝胶电泳检测其条带和多态性，同时拍照。

1.3.4数据统计与遗传多样性分析

分析10条引物扩增后所获得的凝胶电泳结果，有条带出现的为显性位点，用“1”表示，无条带出现的为隐性位点，用“0”代表。根据条带信息建立“1”和“0”矩阵，输入Excel表格，使用Popgene 1.32软件分析得到的矩阵，获取观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、遗传距离和遗传系数等信息，进行遗传多样性的分析。同时，使用NTsys 2.10 e软件分析“1”和“0”矩阵，得到UPGMA聚类树，进行聚类分析，构建22批北苍术种子的亲缘关系树状图。

2 结果分析

2.1 DNA提取结果

不同个体基因组DNA提取后并进行凝胶检测。尽管各个材料DNA提取浓度有差别，但其纯度均较高，没有可见的弥散或杂带出现，保证了ISSR-PCR试验的成功。

2.2 引物和最佳退火温度筛选结果

根据电泳结果，从100条引物中筛选出10条谱带清晰、差异明显、重复性和稳定性高的引物用于22份北苍术种子样品的PCR扩增，引物筛选如图1～图6(图1～图5为同一引物筛选的电泳图)，引物名称及序列见表2。

表2 引物名称及序列

2.3 引物扩增结果

结果表明，ISSR试验共得到了246个清晰位点，其中224个位点具有多态性，总的多态性比率为91.06%。产物片段大小在200～5 000 bp之间，平均每条引物扩增出24条条带。

2.4 不同个体间遗传特征

通过Popgene l.32遗传分析计算可知，22份不同来源北苍术种子的观测等位基因为1.910 6±0.285 9、有效等位基因数为1.421 7±0.340 9、Nei’s基因多样性指数为0.256 1±0.172 5、Shannon’s信息指数为0.395 9±0.230 6。

2.5 不同个体间亲缘关系分析

由表3可知，22份不同来源北苍术种子个体间Nei’s遗传距离值在0.153 5～0.563 7变化，其中遗传距离最小的2个个体类型是12和13，其遗传距离仅为0.153 5，遗传距离最大的个体为6与12和8与12，遗传距离可达0.563 7；不同来源北苍术种质资源之间的遗传相似性系数为0.569 1～0.857 7，其遗传相似性系数值最小为6与12和8与12，其遗传相似性系数为0.569 1，遗传相似系数值最大的为12和13，其值为0.857 7。综上表明，无论基于Nei’s遗传距离还是遗传相似系数，在22个不同来源北苍术种质资源中，亲缘关系最近的是12和13，最远的是6与12和8与12。同时，22份北苍术种子样品的遗传距离和遗传相似性系数均在较大范围内变化，说明该22个个体之间存在较高的遗传多样性，22份北苍术种子样品彼此间遗传变异较大。

表3 不同北苍术个体间遗传相似性系数和遗传距离矩阵

2.6 聚类分析结果

根据遗传相似性进行 UPGMA 聚类分析，构建不同产地北苍术种子的亲缘关系树状，见图7。以遗传相似系数0.75为阈值，22份北苍术样品被分成五大类，即将22批北苍术种子分为五种种质来源，第一类包括1、2、5、21；第二类包括14、15、16、17、18、19、22；第三类包括20；第四类包括内蒙古5个产地；第五类包括陕西5个产地。种质资源遗传关系的相似程度与资源来源地和栽培环境具有一定的相关性[14-15]。同时同一地区的种质间存在差异，这可能与种质的起源进化有关。一个物种的遗传多样性越丰富，变异性越高，资源蕴藏量越大，对环境的适应能力就越强[16]。综上可知，北苍术种子地理位置差异是影响北苍术种质资源遗传多样性的主要因素。

2.7 22批北苍术种子指纹图谱的构建

用筛选的10条引物对不同产地22批北苍术种子建立DNA指纹图谱，通过对比发现6条引物均可单独鉴定出22批北苍术种子，建立的DNA指纹图谱可用于22批不同产地北苍术种质资源的分类与鉴定，可为北苍术种子分子水平鉴别提供参考依据。见表4、表5。

表4 引物811，815，834指纹图谱

3 讨 论

ISSR标记不仅结合了RAPD的通用性，具备AFLP的大部分优点，多态性远比 RAPD、AFLP、SSR丰富，而且操作快捷、安全性较高、成本较低、试验结果更稳定、试验可重复性更好[17]。种质资源间亲缘关系的分析鉴定是进行新品种选育的前提，新品种培育之前须首先明确育种材料间遗传和亲缘关系[18]。许多学者都对茅苍术遗传多样性做了研究[19-22]，暂无对北苍术种质资源进行系统研究。故本试验对北苍术种质进行研究，探明北苍术种质资源的遗传多样性，并通过6条引物DNA图谱区分了22批北苍术种子，对北苍术种子鉴定起到了积极作用，有助于中药材种子市场的监督。