UPLC-MS/MS测定猕猴桃中氯吡脲的不确定度评定

罗 彬，刘正富

（1.重庆市黔江食品药品检验所，重庆 409000；2.重庆市计量质量检测研究院，重庆 409000）

氯吡脲，又称氯吡苯脲，是具有细胞分裂素活性的植物生长调节剂，能够促进细胞的分裂、分化以及器官形成，防止花和果实脱落，进而促进产量增加，其生物活性较强，是6-苄氨基嘌呤的数十倍，被广泛用于农业种植[1-4]。猕猴桃含有多种人体所需氨基酸、富含维生素C、多种微量元素[5]，是一种人们喜爱的水果。本文通过建立不确定度评定的数学模型，确定不确定度的来源，计算液质法测定猕猴桃中氯吡脲含量的不确定度，以保证检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 试剂、材料

乙腈、甲酸、娃哈哈纯净水、无水硫酸镁、氯化钠、QuEChERS（50 mgPSA、150 mg无水硫酸镁，2 mL），氯吡脲标准溶液。

1.2 仪器

Waters Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪（美国沃特世）、XPE204电子天平（梅特勒-托利多）、高速冷冻离心机（贝克曼库尔特）。

1.3 标准溶液制备

氯吡脲标准中间液的配制：准确移取氯吡脲标准溶液（浓度为100 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成浓度为1 μg/mL氯吡脲标准中间液。

标准工作溶液的配制：分别准确移取1 μg/mL氯吡脲标准中间液 50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1000 μL 于5 mL容量瓶中，用空白样品基质溶液配制成浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL 和 200 ng/mL的标准工作曲线。

1.4 试样制备

制样：取代表性样品按GB 2763要求，切碎混匀匀浆，放入洁净容器。

提取：称取样品10 g于离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋3 min；加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，涡旋，离心。

净化：取1.5 mL上清液放入装有50 mg PSA和150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中；涡旋，离心，上清液过滤膜后待测。

1.5 仪器条件

色 谱 柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×50 mm；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；流动相：0.1%甲酸水、乙腈；流速：0.2 mL/min；氯吡脲保留时间为：3.27 min；离子源：ESI；电离模式：正离子；扫描模式：MRM；毛细管电压：2.0 kV；离子对：定量248＞129，定性248＞93；锥孔电压：36 V；碰撞能量：15 V、35 V。

2 数学模型

式中：X为试样中氯吡脲的含量，mg/kg；C为样品溶液中氯吡脲的浓度，ng/mL；V为样品溶液的体积，mL；m为试样的质量，g。

3 标准不确定度评定

3.1 测量过程中不确定度的来源

采用液相色谱-串联质谱法测定猕猴桃中氯吡脲含量，测量过程中不确定度的来源主要有：重复性测定，标准物质含量，标准溶液的配制，标准系列溶液线性拟合，天平、液质联用仪等仪器，试样制备过程中定容体积，加标回收。

3.2 重复性测定引入的不确定度

通过6次测量（p=6），计算出猕猴桃中氯吡脲的含量（X）分别为：0.027 2 mg/kg、0.028 1 mg/kg、0.026 8 mg/kg、0.029 8 mg/kg、0.027 2 mg/kg和0.030 8 mg/kg，平均值（）为 0.028 2 mg/kg，标准偏差为重复性测定试样引入的不确定度为

3.3 标准溶液引入的不确定度

3.3.1 标准物质含量引入的不确定度

由北京坛墨质检科技有限公司提供的浓度为100 μg/mL的氯吡脲标准溶液，相对扩展不确定度为3%（k=2），标准物质含量引入的不确定度为

3.3.2 标准溶液配制引入的不确定度

根据JJG 196—2006、JJG 646—2006，按均匀分布k=，5 mL A级单标线吸取管、10 mL A级单标线吸取管、100 μL 移液枪取 50 μL、100 μL 移液枪取 100 μL、200 μL移液枪取 200 μL、1 000 μL 移液枪取 500 μL、1 000 μL 移液枪取1 000 μL的容量允差分别为±0.020 mL、±0.020 mL、±3.0%、±2.0%、±1.5%、±1.0%、±1.0%，相对标准不确定度分别为0.002 31、0.001 15、0.017 32、0.011 55、0.008 66、0.005 77、0.005 77，使用次数分别为6、1、1、2、1、1、1。标准溶液的配制体积引入的不确定度为：ur(R1)= 0.027 3容量瓶与移液枪的检定温度为20 ℃，配制标准溶液的环境温度为（20±2） ℃，乙腈的体积膨胀系数为 1.37×10-3℃-1，相对标准不确定度为标准溶液的配制温度引入的不确定度为：标准溶液的配制引入的不确定度为：

3.3.3 标准溶液引入的不确定度

标准溶液引入的不确定度为：ur(B)=

3.4 线性拟合引入的不确定度

测量标准工作溶液，标液浓度cj为：10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL，峰面积yj为：1 603、3 098、6 492、15 974、32 974，标液浓度的平均值=74 ng/mL，通过最小二乘法拟合得到线性方程y=165.03c-183.7，斜率a=165.03，截距b=-183.7，r2=0.999 8。平行测量6次样品（p=6），由线性方程求出的样品溶液中氯吡脲的浓度分别为27.415 ng/mL、28.191 ng/mL、26.913 ng/mL、29.807 ng/mL、27.402 ng/mL 和 30.893 ng/mL，样品溶液中氯吡脲的平均浓度c样=28.437 ng/mL。线性拟合引入的不确定度为：

其中：峰面积测定的标准偏差S(y)=标准溶液浓度的方差Sx=n为测定标准溶液的次数（n=5）。

3.5 天平称样引入的不确定度

称取样品所用的电子天平，检定证书给出的允差为±0.2 mg，按均匀分布称样量为10.041 1 g，称样引入的不确定度为

3.6 试样制备过程中定容体积引入的不确定度

试样制备过程加入10 mL乙腈，根据JJG 196—2006，10 mL A级单标线吸取管的容量允差为±0.020 mL，按均匀分布吸取管引入的不确定度为温度引入的相对标准不确定度

3.7 超高效液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度

使用液质联用仪测定猕猴桃中氯吡脲含量，检定证书给出的相对标准不确定度为4.2%（k=2），超高效液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度为

3.8 加标回收引入的不确定度

在猕猴桃样品中加入氯吡脲标准中间液，氯吡脲添加量为0.028 mg/kg。平行测量6次（z=6），测得的回收率f分别为：97.2%、95.8%、91.0%、93.4%、95.3%、91.5%，平均回收率为94.0%，回收率的标准偏差S（f）=0.024 8，加标回收引入的不确定度为

3.9 合成标准不确定度

猕猴桃中氯吡脲含量的合成相对标准不确定度为：

猕猴桃中氯吡脲含量为0.028 2 mg/kg，合成不确定度为u=0.048 3×0.028 2=0.001 36 mg/kg。

3.10 扩展不确定度

置信水平为95%时，k=2，扩展不确定度为：U=0.001 36×2=0.002 72 mg/kg。

根据标准要求，结果保留两位有效数字，猕猴桃中氯吡脲含量报告的表示，结果为：X=（0.028±0.003） mg/kg，k=2。

4 结论

通过不确定度分析，天平称取样品对不确定度的影响很小，不确定度主要来源于重复性、标准溶液制备、线性拟合、仪器稳定性。在今后的检测中，相关人员需要关注以上几个方面，以保证结果的准确性、可靠性、科学性。