支气管肺泡灌洗液宏基因组二代测序在诊断PD-1抑制剂相关性肺炎中的价值

李 勇， 吴迎宵， 李晓平， 吴 峰

肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康[1]。晚期肺癌患者使用免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICI)进行免疫治疗，已体现出较显著的长期生存获益[2]。但随着ICI应用的增加，ICI相关肺炎(checkpoint inhibitor pneumonitis，CIP)的发生率也增加，并逐渐引起重视[3-4]。由于CIP患者的临床症状不典型[5-6]，较难与肺部感染鉴别，肺部影像学检查的鉴别作用存在一定局限，且部分患者表现为CIP合并肺部感染，临床上易漏诊或误诊。如何提高CIP的诊断率，及时发现合并肺部感染，并精准用药，是提高肺癌患者生存期的关键。本研究拟探讨支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)宏基因组二代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)检测在CIP临床诊治过程中的应用，为CIP伴有或不伴有肺部感染的传统诊断方案提供新的临床思路，指导临床确定治疗方案。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2018年5月-2021年1月住院的Ⅲ/Ⅳ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者30例，均经PD-1抑制剂免疫治疗后出现CIP。诊断标准根据中华医学会呼吸病学分会肺癌学组2019年《免疫检查点抑制剂相关肺炎诊治专家共识》[7]，分期参照肺癌TNM分期标准(第8版)。纳入标准：经病理确诊的初治NSCLC患者，排除严重心、肝、肾、血液、内分泌系统功能异常和风湿结缔组织病者。排除不合作或精神不正常者。

1.2 方法

1.2.1 电子支气管镜检查 按电子支气管镜检查常规操作[8]，在目标支气管处注入37 ℃的灭菌生理盐水2次，每次20～30 mL，行支气管肺泡灌洗，回收率为30%～50%，行BALF/痰培养和抗酸染色涂片，并于气管镜检查当天行血常规、超敏-C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，Hs-CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)、血清1,3-β-D-葡聚糖含量测定(G试验)、半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)实验。

1.2.2 mNGS检测 mNGS由福州金域医学检验实验室有限公司进行检测。收集到的BALF进行核酸提取、定量及构建文库、文库质控，最终进行75 bp单端测序。高通量测序的原始数据通过去除低质量碱基、接头序列、重复序列和短序列(<40 bp)，获得优质数据。

1.2.3 治疗方案 (1)mNGS阴性组，拟诊“CIP”并予规范激素抗炎治疗。1级：对症支持治疗，密切随访；2级：甲泼尼龙1～2 mg/(kg·d)静脉给药，改善后口服，症状及影像学表现改善后逐渐减量，疗程>6周；3级：甲泼尼龙2～4 mg/(kg·d)静脉给药或采用其他等效药物，症状及影像学表现改善后逐渐减量，疗程>8周。(2)mNGS阳性组，拟诊“CIP合并肺部感染”并予规范激素联合抗感染治疗，激素治疗方案同mNGS阴性组，治疗期间密切观察患者的病情变化，监测血氧饱和度。1～2级CIP逆转后，继续维持原免疫治疗；3级CIP，即使逆转也终止免疫治疗。患者均随访至今。

1.3 统计学处理 采用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料采用两独立样本t检验，P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 30例中，男性23例，女性7例；年龄(63.80±7.27)岁(48～78岁)；肺鳞癌3例，肺腺癌27例；脑转移3例；Ⅲ期18例，Ⅳ期12例；CIP 1级6例，2级20例，3级4例；合并癌性淋巴管炎3例；有放疗史2例。有呼吸道症状25例，无明显症状5例，其中呼吸困难18例，咳嗽9例，胸部闷痛8例，乏力5例，发热3例。

2.2 BALF mNGS检测和传统病原学检测结果 BALF mNGS结果显示，阳性14例，阴性16例。14例阳性患者共检出病原体24株，其中6例为混合感染。病原微生物排名前3位的分别为铜绿假单胞菌(25.0%)、肺炎链球菌(16.7%)和白色假丝酵母菌(12.5%)。两组间的白细胞计数、PCT和Hs-CRP检测结果见表1。mNGS阳性组中BALF培养/核酸检测/抗酸染色均为阴性，痰培养可检出常见致病菌，如铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、白色假丝酵母菌等，但未检出肺孢子菌、非结核分枝杆菌和曲霉菌，两组的病原微生物检测结果及血清G、GM试验结果见表2。

表1 两组的BALF mNGS检测结果及各炎症指标比较

表2 BALF mNGS检测与传统病原微生物检测阳性结果比较

2.3 治疗情况 mNGS阴性组16例，mNGS阳性组14例，经相应治疗后，病情均获得改善。1例1级CIP患者检出非结核分枝杆菌，予规则抗结核治疗6～9个月后病情改善。肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多噬伯克霍尔德氏菌感染患者均予注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(3 g，q 12 h)抗感染治疗2～3周，咳嗽、咳痰症状改善后，改口服头孢地尼序贯治疗。耶氏肺孢子菌感染患者予复方新诺明(3#,q 6 h)治疗2周后改善，维持治疗4周。腺病毒感染予对症处理，巨细胞病毒、人疱疹病毒7型感染均予膦甲酸钠氯化钠注射液治疗(60 mg/kg，q 8 h)，治疗2周后改善。1～2级CIP逆转后，均维持原免疫治疗。1级CIP 6例，免疫治疗再挑战后，未再出现CIP。2级CIP 20例，再挑战后，其中8例再次出现CIP，6例可疑CIP，6例未再出现CIP；确诊及可疑CIP的患者均停止免疫治疗，其中7例患者改为化疗。3级CIP 4例，逆转后，终止免疫治疗。截至目前，3级CIP失联2例，死亡2例；2级CIP失联6例，死亡2例，余下12例随访中(8例疾病进展，4例疾病稳定)；1级CIP 6例均随访中，疾病稳定。

3 讨 论

近年来，由于ICI在肺癌患者中的广泛使用，CIP越发引起重视。由于肺癌患者容易合并阻塞性肺炎、肺不张、肺实变、胸腔积液等并发症[9]，尤其是接受免疫治疗后，容易出现包括真菌、病毒、结核杆菌在内的各种机会性感染[10-12]。一旦出现CIP，如何鉴别是否合并肺部感染，是临床医务人员面临的难题。CIP是排除性诊断[13]，需除外感染、肿瘤进展、肺栓塞、心功能不全等。目前临床上主要结合各类炎症指标(WBC、PCT、Hs-CRP等)及传统病原学检测协助诊断[14]，若经验性抗菌治疗无效，而激素治疗有效，则进一步支持CIP的诊断，但临床反馈效果一般。

传统微生物培养方法阳性率低，而PCR检测虽灵敏度、特异度和检测时效均明显优于传统培养法，但仍无法满足临床需要[15]。mNGS直接对临床样本(包括血液、体液、痰液、咽拭子等)的核酸进行高通量测序，再经生物信息学分析鉴定，获得病原学微生物的序列数、覆盖度等定量分析数据。与传统检测方法比较，mNGS无需培养，病原覆盖面广、灵敏度高[16-17]。

本研究发现，mNGS阳性组和阴性组的WBC、PCT、Hs-CRP差别无统计学意义(P>0.05)，原因可能是患者在接受免疫联合化疗后，骨髓活性受到不同程度的抑制，同时部分化疗药需激素预处理，均可导致患者体内WBC水平不稳定，无法真实反映客观感染情况。另外，Hs-CRP检测特异性较低，同时无法排除支气管肺泡灌洗部位不够精准的可能，均可能影响检测结果，可扩大样本量继续关注该问题。mNGS阳性组通过精准抗感染治疗，最终获得改善；mNGS阴性组排除肺部感染，维持激素抗炎治疗后，病情也得到逆转。提示mNGS敏感性高，可协助CIP诊断。与Chiu等[18]的研究结果一致。但本研究也显示，并非所有mNGS检测阳性的患者均合并肺部感染，尤其是序列数少、相对丰度低的常见病原体，可能仅是定殖菌。

进一步分析发现，BALF培养/核酸检测/抗酸染色均为阴性，对于常见的致病细菌、真菌、病毒、结核杆菌检出率极低，原因可能是免疫治疗后，患者肺部免疫细胞及免疫因子大量聚集，导致BALF阳性率低下。痰培养对于常见的肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、白色假丝酵母菌等有一定诊断价值，阳性率虽低于BALF mNGS，但二者差别并无统计学意义，与文献报道一致[15]。关于真菌感染的血清学检测，G实验同步检出，GM实验并未检出。二者检测结果受患者临床用药及生化指标影响较大，敏感性、特异性较低[19]。

Wang等[20]通过与传统检测方法进行比较，发现mNGS更易检出混合性病原体感染，对真菌及其分型具有明显优势。Zinter等[21]对免疫低下人群的下呼吸道样本进行mNGS检测，结果显示，在45.8%传统检测方法结果显示阴性的标本中可识别出机会性病原体，如孢子菌、曲霉菌、结核杆菌等。由于肺孢子菌负荷量低，使用普通方法检测容易漏诊，多个研究报道[22-23]均通过mNGS成功快速检出肺孢子菌。本研究中，通过mNGS检测也发现CIP患者出现机会性感染的概率增加，发现鸟型分枝杆菌复合体1例、耶氏肺孢子菌1例、曲霉菌2例、腺病毒2例、巨细胞病毒1例、人疱疹病毒7型2例，且均为合并细菌感染的混合感染，说明mNGS检测可提高临床上机会性感染或混合感染患者的诊断率，进一步证实了Wang等[20]的研究结果。

综上所述，对于临床拟诊CIP的患者行BALF mNGS，在判断CIP是否合并肺部机会性感染乃至多重感染的临床价值可能较高。但mNGS阳性者尚不能确诊为肺部感染，仍需结合临床特征进行综合分析，且传统病原学检测方法在常见致病菌感染的诊断上仍有一定价值。另外，mNGS也暴露出一些缺点：mNGS临床收费偏高；检测结果判读尚无统一标准；目前尚无法提供药敏结果。鉴于mNGS可对病原菌的基因组进行测序，评估耐药基因的多样性及抗性，进而发现新的耐药靶点[24]，可于今后扩大临床样本量，密切结合临床经验进一步探索与研究。