连续高强度微波辐射致大鼠识别记忆障碍及组织结构损伤的定量研究

吴 悠，赖云菲，赵海霞，董 霁，徐新萍，赵 黎，张 静，王 惠，姚斌伟，王浩宇，彭瑞云

(军事科学院 军事医学研究院辐射医学研究所,北京 100850)

0 引言

微波是指300 MHz～300 GHz的电磁波。随着工业、军事等领域的发展，微波已被广泛应用于生活的各个方面。脑是微波辐射最敏感的靶器官之一。既往研究表明，一定剂量的微波辐射可导致大鼠记忆功能下降[1-3]。识别记忆是识别与回忆的集合，主要包含两种主观体验：一种是熟悉感; 另一种是回忆。识别记忆是人类和动物辨认熟悉与陌生事务，降低后续学习成本的重要认知功能[4]。然而，既往研究主要关注微波辐射对空间学习和记忆功能的影响[5]，针对连续高强度微波辐射对大鼠识别记忆的影响及相关脑组织结构基础的研究尚未见报道。

本研究采用新物体识别(novel object recognition, NOR)实验范式检测连续高强度微波辐射后大鼠识别记忆功能的改变。同时，采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和尼氏体染色方法检测定性及定量地对微波辐射后大鼠海马神经元组织结构以及功能状态进行检测和评估，以期为连续高强度微波辐射致识别记忆功能损伤的诊断和防治方法的开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

本研究使用36只9周龄雄性Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，中国)，体重220～240 g，随机分为2组：对照组(sham组)和辐射组(exposure组)，每组18只。动物饲养期间可以自由的获取水和食物，饲养温度22～25℃，湿度40%～55%，时间控制为12 h光照/12 h黑暗，光照时间早9:00—晚9:00，黑暗时间晚9:00至早9:00。行为学检测在光照时间的中间时段进行。所有动物在实验前均获得了充足的休息。所有实验均遵循实验动物伦理标准指南，尽量减少动物的痛苦并减少使用动物的数量。

1.2 微波辐射方法

将大鼠固定在有机玻璃盒中。采用微波辐射源对大鼠进行全身均匀辐射。辐射期间将大鼠装进圆形辐射盒内，头部朝向辐射源中心。每天辐射时长30 min/d共5 d，辐射平均功率密度为50 mW/cm2。对照组不接受微波辐射，其余控制条件与辐射组相同。

1.3 新物体识别测试

使用新物体识别的实验范式测量大鼠的识别记忆。在辐射前1 d、辐射后1 d两个时间点进行测量。新物体识别旷场大小为50 cm×50 cm×40 cm，每只动物实验前允许在旷场内自由探索10 min以适应环境，保证其实验时不会因紧张而影响识别。新物体识别测试分为学习阶段和测试阶段，每个阶段均为5 min，学习阶段在旷场内左右对称位置放置两个完全相同的物体，测试阶段将其中一个物体换成大小相近形状完全不同的物体。使用行为学实验软件Anymaze(Stoelting, USA)进行动物行为记录和数据记录。共记录测试阶段的移动距离、平均速度和辨别指数(discrimination index, DI:DI=TN/(TN+TF)，其中TN为大鼠探索新物体时间，TF为大鼠探索旧物体时间)。

1.4 大鼠海马组织结构观察

各组大鼠于微波辐射5 d后，用1%的戊巴比妥钠麻醉后断头处死，将脑部完整取出后放置于冰盒上，取右脑部分放入福尔马林中固定两周。固定完成后，取海马部分最大面，沿海马方向切成厚度约0.5 cm的脑组织放入包埋盒中。将脑组织用流水冲洗12 h后放入自动脱水机中进行脱水、透明和浸蜡。将脱水完成的脑组织进行石蜡包埋，并修剪成一致大小。将脑组织放在石蜡切片机上切成3 μm厚度的切片，将切片平铺于载玻片上，置于60℃恒温箱内干燥过夜。将制备好的切片放入不同浓度梯度的酒精中浸泡脱腊，脱腊完成后放在温水中保持。按顺序分别放在苏木素染液浸泡12 min，伊红染液浸泡 3 min。染色完成后按顺序放置于不同浓度梯度的酒精和二甲苯中脱水。脱水完成后使用中性树脂封片并使用光学显微镜观察。

1.5 大鼠海马组织神经元尼氏体染色和定量分析

取微波辐射后5 d的海马组织切片脱腊完成后放在温水中保持(同HE染色)。将切片放入甲苯胺蓝染液中染色10 min，然后在95%酒精中分化3 s，梯度乙醇和二甲苯脱水后，用中性树胶封片。染色完成后使用电子显微镜观察并拍照记录。将拍摄的海马区尼氏体图像使用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics, USA)进行平均光密度(mean optical density, MOD)定量分析。

1.6 数据统计和分析

所有数据均使用SPSS 22.0软件(IBM, America)进行独立样本T检验，使用箱须图法剔除异常数据。文中数据均以平均数和标准差(standard deviation, SD)表述，使用P值比较组间差异，置信区间95%，P<0.05被认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 大鼠微波辐射前后体重变化

大鼠微波辐射前后体重如图1A和1B所示。微波辐射前，辐射组和对照组大鼠体重相近，无明显差异。微波辐射5 d后，辐射组与对照组体重无显著差异。

图1 微波辐射前后对照组和辐射组大鼠体重比较A：微波辐射前对照组和辐射组大鼠体重；B：微波辐射后对照组和辐射组大鼠体重

2.2 微波辐射后大鼠识别记忆能力降低

微波辐射后新物体识别时各组大鼠移动距离如图2A所示，辐射组大鼠移动距离显著低于对照组(n=18,P<0.05)。电磁辐射后新物体识别时各组大鼠平均速度如图2B所示，辐射组大鼠平均速度显著低于对照组(n=18,P<0.05)。电磁辐射后新物体识别时各组大鼠辨别指数如图2C所示，辐射组大鼠辨别指数显著低于对照组(n=18,P<0.05)。

图2 微波辐射后新物体识别实验对照组和辐射组大鼠移动距离、平均速度、辨别指数比较A：微波辐射后对照组和辐射组大鼠移动距离；B：微波辐射后对照组和辐射组大鼠平均速度；C：微波辐射后对照组和辐射组大鼠辨别指数。*示P<0. 05

2.3 微波辐射后大鼠海马组织结构损伤

通过光学显微镜观察可见，对照组大鼠海马组织结构正常，神经元排列整齐，胞质均匀(图3A和图3C)。微波辐射组大鼠海马组织损伤明显，主要表现为神经元核固缩、深染，以CA3区最为明显(图3B和3D)。

图3 微波辐射后对照组和辐射组大鼠海马组织HE染色结果比较A：微波辐射后对照组大鼠海马组织结构(Scale bar= 100 μm)；B：微波辐射后辐射组大鼠海马组织结构(Scale bar= 100 μm)；C：微波辐射后对照组大鼠海马组织结构(Scale bar= 50 μm)；D：微波辐射后辐射组大鼠海马组织结构(Scale bar= 50 μm)

2.4 大鼠海马组织神经元尼氏体含量变化

对照组大鼠海马神经元尼氏体含量丰富(图4A和图4C)，辐射组大鼠海马神经元尼氏体含量明显减少(图4B和图4D)。定量分析表明，辐射组大鼠海马组织神经元尼氏体平均光密度(mean optical density, MOD)与对照组相比显著降低(n=6,P<0.05)。

图4 微波辐射后对照组和辐射组大鼠海马尼氏体染色结果比较A：微波辐射后对照组大鼠海马神经元尼氏体图像，示尼氏体含量丰富(Scale bar= 100 μm)；B：微波辐射后辐射组大鼠海马神经元尼氏体图像，示尼氏体含量明显减少(Scale bar= 100 μm)；C：微波辐射后对照组大鼠海马神经元尼氏体图像，示尼氏体含量丰富(Scale bar= 50 μm)；D：微波辐射后辐射组大鼠海马神经元尼氏体图像，示尼氏体含量明显减少(Scale bar= 50 μm)。E：微波辐射后对照组和辐射组大鼠海马神经元尼氏体平均光密度(MOD)比较。*示P<0.05

3 讨论

随着电子技术的发展，电磁辐射逐渐成为继空气、水体、噪声污染之后的第四大环境污染源[6]。脑是微波辐射的敏感靶器官，既往研究表明，微波辐射会对大鼠脑组织结构造成损伤，从而引起相关认知功能障碍。Karimi N等[7]发现2.45 GHz微波辐射会导致大鼠空间学习和记忆能力受损。Ma D等[8]发现30 mW/cm2微波辐射可以导致大鼠学习记忆损伤，以及海马组织中氨基酸类、胆碱类神经递质代谢紊乱。徐新萍等[9]发现10 mW/cm2微波连续辐射3 d后大鼠学习记忆功能受损，海马区组织结构异常。

然而，目前针对连续高强度微波辐射造成的识别记忆障碍及其组织结构基础的研究尚未见报道。许多神经退行性疾病(如阿尔茨海默症、精神分裂症)均会对识别记忆能力造成影响[10-12]。新物体识别是评估啮齿动物对新异物体偏好的方法。可以对动物的识别记忆进行评估[13]。本研究发现，在新物体识别检测中，在50 mW/cm2微波辐射后，与对照组相比辐射组大鼠移动距离和平均速度均显著下降(移动距离：P<0.05，平均速度：P<0.05)，表明大鼠的运动欲望和运动能力显著减弱。同时，本研究发现，与对照组相比辐射组大鼠辨别指数显著下降(P<0.05)，表明大鼠的对新异物体的识别和探索欲望降低，提示50 mW/cm2连续高强度微波辐射后大鼠识别记忆出现障碍。

海马区是识别记忆执行所依赖的重要脑区，海马结构的损伤与识别记忆功能障碍密切相关[14]。为了阐明连续高强度微波辐射诱发大鼠识别记忆障碍的组织结构基础，我们对辐射后大鼠海马神经元组织结构状态分别进行了定性和定量的检测和分析。一方面，一定剂量微波辐射可导致大鼠海马神经元组织结构损伤[15-17]。李文潮等[18]发现30 mW/cm2微波辐射可导致海马组织DG去锥体细胞胞浆部分胞盒呈阳性。Zhao L等[16]发现30 mW/cm2微波辐射后大鼠海马线粒体超微结构变化，主要表现为海马组织轻度水肿、线粒体嵴不规则、肿胀、空泡化。本研究发现，在连续高强度微波辐射后，辐射组大鼠与对照组大鼠相比， 海马区神经元形态异常，主要表现为核固缩、深染。另一方面，既往研究表明，一定剂量微波辐射可导致大鼠海马神经元胞浆内尼氏体的含量下降。Chen J等[5]发现连续高强度微波辐射均可导致大鼠海马神经元尼氏体减少。任俊辉等[19]发现30 mW/cm2微波辐射可以导致大鼠海马和皮层神经元尼氏体含量均显著减少。尼氏体主要由粗面内质网和游离的核糖体组成，是神经元的重要结构特征，且与神经元的状态和功能密切相关。当神经元损伤时，尼氏体往往会溶解消失。因此，尼氏体染色可反映神经元的损伤情况。在本研究中，50 mW/cm2微波辐射后大鼠海马神经元尼氏体含量减少。上述结果提示，连续高强度微波辐射造成的识别记忆障碍的组织结构基础为海马神经元组织结构损伤。

综上，连续高强度微波辐射可造成大鼠海马区神经元组织结构损伤，从而引发大鼠识别记忆障碍。本研究首次探索了连续高剂量、连续高强度微波辐射对大鼠识别记忆的影响，为其损伤诊断和防治方法的开发奠定基础。