长春地区2051例女性人乳头瘤病毒检测基因类型及感染人群特征分析

杜珍武，艾冬晴，李智慧，李 楠，马锦浩，张楚群，张桂珍,

(1.长春肿瘤医院 基因检测中心，长春 130012；2.吉林大学 第二医院骨科研究所，长春 130041)

0 引言

人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)属于乳头瘤空泡病毒科，含有双链DNA基因组，遗传物质被一个二十面体衣壳包围，病毒具有高度的组织特异性，可感染皮肤和粘膜上皮。根据编码主要衣壳蛋白的基因组序列，已经鉴定了200多种HPV类型[1]，其中至少有14种可能导致癌症的高危类型[2]。两种高危HPV类型(16和18)导致与HPV相关的癌症最多，约70%的宫颈癌和癌前宫颈病变与这两种类型感染相关[3]。其他与宫颈癌密切相关的高危HPV类型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68[4]。

据统计，到2018年在全世界范围内，高风险HPV导致约5%的癌症病例，估计每年女性感染人数为570 000，约有311 000名妇女死于宫颈癌，我国患者占总数的1/15[5]。实施宫颈癌早期筛查，提供及时的防治手段是有效降低宫颈癌死亡率的重要策略，其中通过HPV病毒感染的定期监测是宫颈癌早期防治的重要手段[6]。然而，由于人口、地理和种族因素的差异，HPV感染率和基因型分布具有国家和地区差异[7-10]，导致HPV感染诱导的宫颈癌前病变及不同癌亚型的分布差异，从而对宫颈癌防治方案制定产生影响[11-12]。因此，充分调查各地区HPV的感染和基因型分布情况，对于制定适当的宫颈癌监测、预防和控制策略，是非常重要的。

通过查阅相关文献发现，国内多个地区报道了HPV感染流行病学调查分析，而长春地区HPV的感染流行病学调查分析报道较少，并且数据来源于3年前，不能有效地反应当前本地区HPV的感染情况[13-15]。因此，本研究拟对2020年至2021年吉林省长春地区女性检测HPV感染的资料进行了分析，对感染的HPV基因类型及感染人群特征进行评估，为该地区HPV疫苗的接种与HPV筛查以及全国HPV感染情况流行性调查提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本一般资料

2051例女性标本来源于 2020年10月至2021年11月在长春肿瘤医院基因检测中心检查的健康体检人群、门诊及住院患者。检测人群全部来自吉林省长春地区，年龄 15～79 岁，平均(42±11) 岁。按照年龄段共分为5组：15～30岁、30～40岁、40～50岁、50～60岁及60岁以上。所有患者均为初次HPV检测，排除第2次复检数据。

1.2 仪器与试剂

基因扩增仪为ABI 2720 PCR仪(美国THERMO公司)；分子杂交仪为凯普HHM-3型分子杂交仪(潮州凯普公司)；人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒(PCR-膜杂交法) 购自潮州凯普生物化学有限公司。

1.3 宫颈脱落细胞标本采集

由医生以扩阴器暴露宫颈口，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。将宫颈刷伸入宫颈口处，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3～5圈，慢慢取出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的样本管中。在管口处将多余的刷柄折断，将刷头留在样本管中,旋紧管盖，并注明编号和日期。样本保存后，如不能马上检测，将样本置于冰箱在4℃存放，并在两周时间内检测,避免反复冻融。

1.4 HPV分型检测方法

按照人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒(PCR-膜杂交法) 操作过程进行检测，主要过程如下：①应用基因组DNA提取试剂盒提取采集的宫颈脱落细胞DNA，以此DNA为模板扩增出21种HPV基因型的目的片段；②将扩增产物与固定在膜条上的包括15种高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型)和6种低危型(6、11、42、43、44、81型)在内的分型探针以及内控探针进行杂交。杂交膜用肉眼观察，膜上所在圆圈见紫蓝色圆点判断为阳性，反之则为阴性。根据膜条上不同HPV分型分布图判断HPV分型。

1.5 统计学处理

应用IBM SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV基因总体检测结果

2051例样本共检出329例阳性标本，总阳性率为16.05%。其中单独感染低危HPV的样本为19例(占0.93%)，单独感染高危HPV样本为298例(占14.53%)，高低危HPV混合感染样本为12例(占0.59%)。在310例高危HPV感染的样本中，存在单一HPV基因分型及多个HPV基因分型同步感染的样本，检测结果如图1所示。其中单一HPV分型感染样本为256例(占12.48%)，2个HPV基因分型感染样本为43例(占2.09%)，3个HPV基因分型感染样本为9例(占0.44%)，4个HPV基因分型感染样本为1例(占0.05%)，5个HPV基因分型感染样本为1例(占0.05%)。2个以上HPV基因分型感染率具体情况如表1所示。本部分结果括号中的百分比均为样本例数除以总样本数。

图1 PCR-膜杂交法进行HPV基因分型检测结果图(除内控外，膜上出现紫蓝色的每一个圆点代表一个HPV基因分型)

表1 高危HPV多个分型多重感染分布特征

2.2 HPV基因分型分布

在测序的21 种 HPV 基因亚型中，只有HPV42型未在样本中检出，其他亚型具有不同程度的检出。高危型感染前5 位的亚型分别是:HPV16(3.61%)、HPV52(2.93%)、HPV58(2.10%)、HPV53(1.76%)和HPV31(1.22%)。具体HPV基因分型分布情况如图2所示。本结果统计各个高危亚型阳型数量为单纯感染与多重感染阳性样本之和。

图2 长春地区女性感染 HPV 基因亚型分布情况本图感染率(%)=(各HPV基因分型阳性数目)/ 2051(总人数)×100%

2.3 不同年龄段HPV检出情况

通过对不同年龄段的HPV感染分析结果显示，高危HPV阳性率最高是60岁以上人群(占21.54%)，其次为15～30年龄段人群(占19.33%)。如表2所示，60岁以上人群高危HPV感染率与15～30年龄段人群感染率无差异，但与其他年龄段感染率相比具有显著差异，均有统计学意义(P<0.05)。15～30年龄段人群高危HPV感染率与31～40年龄段人群及51～60年龄段人群感染率相比具有显著差异，均有统计学意义(P<0. 05)。

表2 不同年龄段的高危HPV感染率

2.4 高感染率的高危HPV分型在不同年龄段感染情况

分析前3个高感染率的HPV16、52及53型在不同年龄段感染率，结果显示HPV16型的高感染率年龄阶段在41～50岁，而HPV52主要在15～30及60岁以上的年龄阶段，HPV53的高感染率年龄阶段在41岁以后。具体结果如图3所示。

图3 HPV16、52及53分析在不同年龄阶段感染情况

2.5 15～30年龄段感染高危HPV基因型分布

通过上述分析发现15～30年龄段属于高危HPV感染的高年龄段，进一步分析其感染的HPV基因型发现这一年龄段高危型感染前4 位的亚型分别是：HPV52(4.20%)、HPV16(3.72%)、HPV58(3.78%)和HPV31(2.94%)。具体HPV基因分型分布情况如图4所示。

图4 15～30年龄段感染高危HPV基因型分布图注：计算感染率=(各HPV基因分型阳性数目)/ 238(本年龄段人数)

3 讨论

本研究通过对2051例长春地区健康女性宫颈上皮细胞样本HPV基因检测结果分析，评估了HPV在人群中感染情况及相关基因型分布，对HPV在本地区的流行特点提供相关数据。本研究数据显示，HPV在本地区人群中的总体阳性率为16.05%，其中以高危HPV感染为主(占总感染样本的91%)。本研究的HPV感染率与高超等报道的2018年长春地区505例女性体检人群HPV毒感染率(13.7%)一致[14]，低于朱科静等报道的2018年长春地区946例HPV总感染率(30.23%)[15]，说明在同一地区由于检测人群及检测方法不同，造成检测感染率不同。因此，对于本地区HPV毒感染率需要综合多个报道文献进行分析。本研究获得感染率与YU HAO等总结的我国多个省市HPV感染率(12.09%～30.21%)相比属于低水平感染地区[10]，这说明了HPV感染存在地区差异。

本研究检出的310例高危HPV感染的样本中包括单一HPV基因型与多个HPV基因型感染，其中以单一HPV基因分型为主(256例，82.56%)，HPV基因型混合检出中(54例，17.44%)以双HPV分型检出为主(43例，79.63%)，本研究最多检测到5种HPV基因型混合感染。通过分析这些混合感染发现以HPV16型及52型混合感染为主。在本研究中高危HPV检出率最高的前五位是：HPV16(3.61%)、HPV52(2.93%)、HPV58(2.10%)、HPV53(1.76%)和HPV31(1.22%)。最近国内相关报道的高危HPV检出率最高的HPV基因型基本为这五个型，只是不同地区的感染率略有不同[16-20]。当前针对HPV疫苗包括二价疫苗(针对HPV16、18型)、四价疫苗(针对HPV6、11、16、18型)和九价疫苗(针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58型)。通过上述HPV感染基因型分析结果提示，接种九价疫苗可能产生对人群更好的HPV感染防护。因此，及时了解本地区的HPV不同基因型感染流行特点，对其防治有重要指导作用。

关于不同年龄段HPV感染率，多数文献报道了感染率随年龄呈“双峰”分布,感染高峰在30岁之前及60岁之后[21-22]，本研究的不同年龄段HPV感染率也符合这个规律。在30岁之前的HPV高感染可能与性生活混乱以及免疫功能不健全相关，但随着免疫功能逐渐完善，感染的HPV病毒被清除[23]。60岁后感染增多与免疫功能低下，以往隐藏的病毒重新激活，这种感染容易发生长期慢性感染，并造成宫颈癌[24].由于最近几年宫颈癌发生的年轻化，对于青年女性的HPV检测受到重视，特别是HPV感染的流行性调查发现30岁之前感染率高。朱科静等对2017—2018年吉林省15～35岁的性活跃人群人乳头瘤病毒感染情况进行研究，发现其感染率为35.02%，而本研究该阶段的感染率为19.33%，说明随着人们对于HPV感染重视，其感染率有所下降。因此，了解这部分人群HPV分型对于这部分人群HPV防治有一定指导作用。本研究分析发现在这个阶段感染HPV的基因型主要为：HPV52(4.20%)、HPV16(3.72%)、HPV58(3.78%)和HPV31(2.94%)，这四种HPV分型分布与许珈豪等研究相一致[25]。

总之，通过本研究对吉林长春地区女性检测的HPV感染的资料进行了分析，对感染的HPV基因类型及感染人群特征进行评估，评估长春地区最新的HPV感染率低于国内平均感染率，HPV感染以单一型别感染为主，其中高危型HPV16、52、58亚型为主要感染型别；感染年龄段以60岁以上人群及年轻人(小于30岁)为主，为本地区HPV疫苗的接种与HPV筛查以及为全国HPV感染情况流行性调查提供科学依据。