湖北贝母活性成分与内生菌次级代谢产物研究

袁名远，李宇，谭旭辉，刘玉，方昕悦，冉亚兰，何美军

1.湖北省农业科学院中药材研究所/国家中药材产业技术体系恩施综合试验站，恩施 445000；2.湖北民族大学生物科学与技术学院，恩施 445000； 3.恩施土家族苗族自治州农业农村局，恩施 445000

湖北贝母(FritillariahupehensisHsiao et K. C. Hsia)属百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)，野产于湖北恩施地区，民间称之为“板贝”“窑贝”，常作为川贝使用，药用历史悠久[1]。湖北贝母具有清热润肺、化痰止咳的功效，常用于治疗热痰咳嗽、痰核瘰疬、痈肿疮毒等症状[2]。现代药理学实验表明，湖北贝母具有抑菌[3]、降压[4]、镇咳平喘[5]等功效。贝母素乙是贝母中的重要生物碱成分之一，是《中国药典》中规定的贝母品质定量检测指标，在抑制结肠癌[6]、缓解心肌炎[7]、减轻肺损伤[8]等方面有显著作用。植物内生菌主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三类微生物，在长期的进化中与宿主植物“协同进化”，形成互利共生关系[9]。已有研究发现药用植物中多种重要药用成分紫杉醇、长春花碱、龙血褐、异大戟素和巨大戟醇等均受到植物内生菌诱导合成或积累调控[10]。此外，内生菌能产生具有生物活性的代谢产物，如抗氧化类[11]、抗菌类[12]、抗肿瘤类[13]、生长调节类[14]等物质，在医药和农业方面具有重要意义。

贝母常以鳞茎入药，在其枯萎期采摘，此时贝母地上部分包括花、叶均已枯萎凋落[15]，利用率不高，造成了贝母资源的浪费。截至目前，关于湖北贝母内生菌、次级代谢产物及其抑菌活性的相关研究尚无文献报道。本文通过研究湖北贝母不同组织中活性成分含量、内生菌组成及其次级代谢产物活性，以期为湖北贝母资源的合理开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选择30株1年生、长势一致的湖北贝母健康植株，株高30～40 cm，鳞茎直径2.0～3.0 cm，通过五点采样法于2021年4月15日上午10：00在湖北省恩施市三岔镇采集，由湖北省农业科学院中药材研究所鉴定。标准品贝母素乙和抗生素氨苄青霉素，从阿拉丁试剂有限公司购买；二甲基亚砜、EDTA、苯酚、三氯甲烷、无水乙醇等，从天津科密欧化学试剂有限公司购买。

10株供试细菌(表1)由中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室鉴定和提供。

表1 供试革兰阳性菌和革兰阴性菌类型 Table 1 Tested gram-positive and gram-negative bacteria

DFY-1000中草药磨粉机(温岭市林大机械有限公司)，TS-200B恒温摇床(上海精其仪器有限公司)，BSD-400震荡培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，RE-200A型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，HP4500酶标仪(北京华安麦科生物技术有限公司)等。

1.2 不同组织中贝母素乙含量检测方法

供试样品制备：湖北贝母洗净除杂，鳞茎、花、叶分别装盘置于40 ℃恒温干燥箱干燥，粉碎后过筛(筛孔直径0.27 mm)，按料液质量体积比1∶50 (g/mL)加入乙酸乙酯，超声功率500 W下超声30 min，经减压浓缩、真空干燥得不同组织提取物浸膏。分别取适量浸膏用乙酸乙酯充分溶解，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液进样分析，以分析纯乙酸乙酯进样作为对照组。

色谱条件：Agilent 19091S-433毛细管柱(HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm)。升温程序：初始温度100 ℃，保持3 min；3～15 min，从100 ℃升至280 ℃；15～20 min，温度保持280 ℃不变；20～35 min，从280 ℃升至310 ℃；35～40 min，温度保持310 ℃不变。进样口温度为310 ℃，载气为高纯度氦气(99.999%)，流速为1.8 mL/min，进样量为5 μL，不分流。

采用气相色谱(GC)外标法[16]检测湖北贝母鳞茎、花、叶中贝母素乙的含量，设定贝母素乙标准品质量浓度分别为1.13、2.25、4.50、6.75、9.00、11.25 mg/mL。分别进行精密度和重复性实验，每个样品重复6次，计算回收率和相对标准偏差，公式如下：

式中，C为不同组织中贝母素乙的含量，mg/g；n为气相色谱检测的质量浓度，mg/mL；V为不同组织供试液体积，mL；m为不同组织供试样品质量，g。

1.3 内生菌的分离鉴定

湖北贝母全株表面洗净，4%次氯酸钠溶液消毒、75%乙醇浸泡5 min；无菌水冲洗5～7次，培养观察，确认彻底消毒。无菌条件下将贝母全株于2 mL无菌水中轻柔研磨成悬浮液，稀释涂布培养，(28±2) ℃培养7 d，采用划线法纯化获得单克隆[17]。将纯化的内生菌单克隆接入LB培养基，28 ℃、180 r/min培养24～48 h，提取内生菌基因组DNA为模板，27F、1492R引物扩增细菌16S rDNA序列，ITS1、ITS4引物扩增真菌ITS序列，扩增产物送武汉奥科鼎盛公司测序，将测序结果在GenBank中进行BLSAT分析，获得与菌株同源的16S rDNA、ITS序列，采用 MEGA-X 7.0[18]软件中的邻接法构建内生真菌和细菌的系统发育树。

1.4 内生菌代谢产物抑菌活性测定

运用琼脂扩散法[19]测试4种内生菌次级代谢产物的抑菌活性，配制4种次级代谢产物测试液(100 mg/mL)； 设置阳性对照组(氨苄青霉素)和阴性对照组(DMSO溶液)，测量抑菌圈直径，直径≥20 mm的判断为高敏，10～20 mm为中敏，≤10 mm为轻敏或耐药。运用微量二倍稀释法[20]测定4种内生菌次级代谢产物对供试菌的最小抑菌质量浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌质量浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)，设阳性对照组(加入100 μg/mL氨苄青霉素)，每组重复3次，计算MIC和MBC值[21]。

1.5 数据分析

试验数据运用SPSS 19.0 软件进行统计分析，以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同组织中的贝母素乙含量

通过外标法检测到贝母素乙检出限、定量限分别为15.77、57.27 μg/mL。得到线性回归方程Y=900.30X-49.25 (R2=0.999 6)，表明贝母素乙在1.13～11.25 mg/mL线性关系良好，适合用于分析测定。分别向一定量鳞茎、花、叶供试液中准确添加适量贝母素乙标准品使其质量浓度分别达到1.79、0.78、3.20 mg/mL，采用相同色谱条件进行定量检测，计算得出其加样回收率分别为97.6%、97.4%、98.1%，相对标准偏差RSD分别为1.18%、1.78%、2.70%，表明气相色谱法回收率较好，准确度较高。

如表2所示，气相色谱法检测到湖北贝母鳞茎、花、叶中贝母素乙含量分别为2.24±0.17、0.94±0.13、3.99±0.10 mg/g，说明不同组织中贝母素乙含量具有显著性差异，叶中含量最高，鳞茎次之，花中含量最低，其中贝母叶的含量为鳞茎的1.78倍，为花的4.24倍。

表2 湖北贝母不同组织中贝母素乙含量 Table 2 Content of peiminine B of different tissue of F. hupehensis

2.2 内生菌鉴定及系统发育树构建

对从湖北贝母全株中分离的1株内生细菌(BM-X-6)和3株内生真菌(BM-Z-1、BM-Z-3、BM-Z-5)样品的16S rDNA和ITS序列进行扩增、测序，获得其序列信息，其碱基对全长分别为1 447、596、590、618 bp。利用Blast软件与NCBI数据库中序列进行同源比对，选取相似性≥98%的菌种，应用MEGA-X 7.0软件，选择邻接法，利用极大似然估计法构建内生菌系统发育树(进行1 000次自展检测，Bootstrap值≥80%)基因组的遗传变异度为0.5(图1、图2)。

图1 基于 16S rDNA 序列构建的湖北贝母内生细菌系统发育树Fig.1 16S rDNA phylogenetic tree of endophytic bacteria of F. hupehensis

图2 基于 ITS 序列构建的湖北贝母内生真菌系统发育树Fig.2 ITS phylogenetic tree of endophytic fungi of F. hupehensis.

将BM-X-6内生细菌扩增序列提交到GenBank，获得登录号为MZ477239。由图1湖北贝母内生细菌系统发育树可见，BM-X-6与假单胞菌属(Pseudomonas)的亲缘关系最近，其中BM-X-6与Pseudomonassp. (MG266378.1)序列相似性最高，为99.03%，与Pseudomonashelmanticensis(MK070159.1)和Pseudomonasfluorescens(MK774791.1)等序列相似性也分别达到98.38%和98.95%；据此可以初步将BM-X-6鉴定为假单胞菌属菌株，并命名为Pseudomonassp. BM-X-6。

将BM-Z-1、BM-Z-3、BM-Z-5这3种内生真菌扩增序列提交到GenBank，获得登录号分别为：MZ477229、MZ477231、MZ477232。由图2系统发育树可见，3株内生菌与曲霉菌属(Aspergillus)或节菱孢霉菌属(Arthrinium)存在进化关系。通过比对，BM-Z-5与Arthriniumrasikravindrae(KP269008.1)序列相似性最高，为98.05%; BM-Z-1与Aspergillusversicolor(KX776009.1)等多个序列相似性较高，且与Aspergillustabacinus(MH911388.1)聚为一簇；BM-Z-3与Aspergillussp. BX (KJ567464.1)等多个序列相似性较高，且与Aspergilluscarneus(KM458808.1)聚为一簇，此外BM-Z-1、BM-Z-3还属于同一个分支。综上，可以将BM-Z-5初步鉴定为节菱孢霉菌属菌株，将其命名为Arthriniumsp. BM-Z-5；将BM-Z-1、BM-Z-3初步鉴定为曲霉菌属菌株，并分别命名为Aspergillussp. BM-Z-1、Aspergillussp. BM-Z-3。

2.3 内生菌次级代谢产物抑菌活性分析

如表3所示，琼脂扩散法结果表明，4种内生菌次级代谢产物对10株供试菌有不同的抑菌活性，抑菌圈直径越大说明抑菌效果越强。Aspergillussp. BM-Z-1、Aspergillussp. BM-Z-3、Arthriniumsp. BM-Z-5及Pseudomonassp. BM-X-6这4种次级代谢产物分别对2、3、9、1株供试菌具有中度抑制作用(抑菌圈直径≥10 mm)。其中Arthriniumsp. BM-Z-5次级代谢产物对除枯草芽孢杆菌外的其余9株供试菌均有中度抑制作用，且相较其余3种次级代谢产物，只有Arthriniumsp. BM-Z-5次级代谢产物能对肺炎克雷伯菌(10.90±0.56 mm)、金黄色葡萄球菌(11.56±0.36 mm)、藤黄微球菌(10.07±0.49 mm)、鲍曼不动杆菌(11.94±0.21 mm)以及具有耐抗生素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(10.67±0.24 mm)等5种供试菌起中度抑制作用，呈广谱抑菌特性，而Aspergillussp. BM-Z-1与Pseudomonassp. BM-X-6次级代谢产物只对2种供试菌有抑制作用，抑菌谱最窄；此外，所有的内生菌次级代谢产物都对苏云金芽孢杆菌有良好的抑制作用。

表3 湖北贝母内生菌次级代谢产物的抑菌圈直径 Table 3 Inhibition zone diameter of secondary metabolites of endophytic of F. hupehensis mm

采用微量二倍稀释法进一步测定有明显中度抑菌作用的处理组的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)值，结果如表4所示。由表4可知，相较其余3种次级代谢产物，Aspergillussp. BM-Z-1次级代谢产物对苏云金芽孢杆菌有最强的抑制效果，其MIC值为0.36 mg/mL，MBC值为5.83 mg/mL。Aspergillussp. BM-Z-3次级代谢产物对枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌的抑制效果较好，其MIC值为0.50～1.00 mg/mL，MBC值为8.04～16.08 mg/mL。Arthriniumsp. BM-Z-5次级代谢产物对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有中度抑制活性，其MIC值均为1.59 mg/mL，MBC值为12.76～25.52 mg/mL。

表4 湖北贝母内生菌次级代谢产物的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度 Table 4 MIC and MBC of secondary metabolites of endophytic of F.hupehensis mg/mL

3 讨 论

湖北贝母作为恩施地区道地药材，使用历史悠久，但其药用部位仅采用鳞茎，而花、叶等非药用部位在采收时被丢弃[22-24]。笔者研究发现，湖北贝母不同组织中贝母素乙的含量差异巨大，叶中贝母素乙的含量远高于鳞茎和花。这说明叶、花等地上部分均具有高含量的生物碱活性成分，具有药用前景和潜在的经济价值，可为湖北贝母资源的综合开发利用提供新的思路。

内生菌长期生活在宿主植物体内，是植物微生态系统不可缺少的部分之一。植物内生菌在与植物长期协同进化过程中形成了丰富的微生物资源，不同植物体、甚至同一植物体不同器官中内生菌的多样性和组成都不尽相同[25]。

笔者从湖北贝母中分离出1株假单胞菌Pseudomonassp. BM-X-6，1株节菱孢霉菌Arthriniumsp. BM-Z-5，2株曲霉菌Aspergillussp. BM-Z-1、Aspergillussp. BM-Z-3。同时，这3个内生菌属也在浙贝母[26]、甘蔗[27]、夹竹桃[28]等植物体中被发现。

药用植物与其体内的内生菌之间存在复杂的微生态关系，诱导、胁迫药用植物或者自身能产生抑菌、抗病毒、杀虫、抗氧化、生长调节等物质，提高宿主植物抗逆、抗胁迫和抗病害的能力[29-30]。本研究抑菌结果表明，湖北贝母中分离出的不同内生真菌和内生细菌次级代谢产物均有抑菌活性，但是有较大差异。其中Arthriniumsp. BM-Z-5次级代谢产物抑菌谱最广，且对革兰阳性细菌如金黄色葡萄糖球菌、粪链球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌和鲍曼不动杆菌共5株供试菌有良好的抑制效果。有学者研究发现：从白芨中分离鉴定的1株假单胞菌对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌等有抑菌活性[31]；从紫玉盘中分离鉴定的1株节菱孢霉菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的抑制效果[32]；从浒苔中分离鉴定的1株曲霉菌对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等具有较强的抑制能力[33]。笔者所在课题组前期研究中分离的4株内生菌与这些文献所报道的内生菌虽在同一属，但是抑菌活性的差异较大，推测是其次级代谢产物成分不同所致[34]。

后续将进一步构建湖北贝母无菌愈伤组织、无菌组培苗，再通过共培养4株内生菌的方式研究内生菌对湖北贝母中贝母素乙等生物碱类化合物生物合成与积累的影响规律,并对这些内生菌次级代谢产物的抑菌活性成分进行分离鉴定，以期为开发新型抗菌药物、缓解菌株耐药性提供参考依据。