参草通脉颗粒对慢性心衰大鼠Wnt信号通路配体表达的影响

刘晓蕾，张艳，礼海，王懿

（1.沈阳市第二中医医院医务科，辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学附属医院专家门诊，辽宁 沈阳 110032）

慢性心力衰竭（CHF）是以舒缩功能障碍为主的严重临床综合征，是多种疾病终末期表现。临床治疗多以常规西药为主，重度及顽固性心衰采用心脏再同步治疗、心脏移植等非药物疗法，但上述疗法不良反应多且价格昂贵、应用受限。参草通脉颗粒是临床治疗CHF 的经验方，王辰等[1]前期对280 例CHF 患者通过多中心随机双盲平行实验，发现参草通脉颗粒对CHF 患者具有良好疗效。本研究应用ELISA 法（酶联免疫法），通过经典和非经典Wnt传导通路，分析参草通脉颗粒治疗CHF的疗效机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取体质量为300～350 g，15 周龄，SPF 级SD雄性大鼠90只，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药物制备 赖诺普利片（上海信谊万象药业股份有限公司,批号：20131015，规格：10 mg）。参草通脉颗粒药方组成：丹参、人参、黄芪、红花、三七粉、益母草、茯苓、葶苈子（本溪三药有限公司，批号：辽药制Z0901013）。

1.3 实验试剂和仪器 Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白测定的ELISA试剂盒，低温高速离心机，酶标仪等。

1.4 慢性心衰大鼠动物模型制备 大鼠正常条件下适应性喂养7 d后，为全部动物编号后随机抽取20只为正常组。其余大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔麻醉，气管插管，消毒后在左侧第3、4肋间横向切开长约1～2 cm，逐层分离，暴露视野可见心脏，用缝合线结扎距离左冠脉前降支起始点2～3 mm处，心电图提示胸导ST段和T波出现明显异常，说明结扎成功，将心脏送回胸腔，用注射用青霉素钠（哈药集团制药总厂，国药准字H23021439）手术切口处敷用，大鼠生命体征平稳后，撤掉呼吸机。预防术后感染，连续3 d应用注射青霉素钠30万IU，每天1次。正常饲养1周后，喂养饲料减少1/2；同时，大鼠每天1次力竭式游泳，连续4周。经超声检测左室射血分数（LVEF）≤60%，可判定为心力衰竭[2]。

1.5 实验分组与给药 大鼠在造模前后共死亡11只，将剩余59只大鼠，按照随机数字表法分为模型组（n=19）、参草通脉颗粒组（n=20）、赖诺普利组（n=20），空白对照组为正常喂养未手术造模大鼠（正常组）。正常组和模型组大鼠不用药，灌胃0.9%氯化钠溶液10 mL/kg，每天1次。其余组大鼠用药剂量，按人鼠剂量换算公式，药品剂量（人口服）（g）×0.018/动物体质量（kg）＝剂量（g/kg）[3]，计算出赖诺普利组：1.5 mg生药/kg/d，参草通脉颗粒组：9.2 g 生药/kg/d，两组药溶于3 mL蒸馏水每天灌胃1次，各组连续给药42 d。

1.6 实验取材 大鼠麻醉、处死，腹主动脉取血，常规离心，收集上清液，分装后低温保存，用于检测Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白浓度。

1.7 酶联免疫法 按照试剂盒及仪器要求的操作步骤进行。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以“”表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，参草通脉颗粒组和赖诺普利组大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白水平明显升高（P＜0.01）；与赖诺普利组比较，参草通脉颗粒组大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白水平明显升高（P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比较(，μg/L)Table 1 The protein expression level of Wnt3a,Wnt5a and Wnt11 in the serumof rat in each group(,μg/L)

表1 各组大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比较(，μg/L)Table 1 The protein expression level of Wnt3a,Wnt5a and Wnt11 in the serumof rat in each group(,μg/L)

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与赖诺普利组比较，cP＜0.01

检测项目Wnt3a Wnt5a Wnt11参草通脉颗粒组（n=20）9.51±0.12bc 19.15±0.17bc 7.37±0.21bc正常组（n=20）15.28±0.69 32.18±1.02 12.58±0.63模型组（n=19）5.29±0.33a 10.97±0.64a 4.31±0.15a赖诺普利组（n=20）8.12±0.11b 16.36±0.71b 6.41±0.12b

3 讨论

Wnt 信号通路在CHF 发生发展过程中发挥重要作用，包括经典Wnt 通路和非经典Wnt 通路。Wnt 蛋白分为Wnt-1 族和Wnt-5a 族，Wnt3a 是Wnt 蛋白家族成员之一,是非常重要的Wnt 配体，与经典通路有关，Wnt5a、Wnt11 配体是Wnt-5a族中的主要成员，与非经典通路密切相关[4]。在慢性心衰过程中，研究发现Wnt3a 与FZD 和LRP5/6 受体结合，并激活经典的Wnt-Dvl-β-catenin信号通路，促进心肌肥大效应[5-6]。Wnt5a 和Wnt11 介导Wnt 非经典信号通路，分别激活Wnt/PCP/JNK通路和Wnt/Ca2+信号通路，诱导心肌肥厚[7]。另一项研究结果显示，在心肌肥大小鼠模型中，经典与非经典Wnt信号通路均被激活，Wnt3a和Wnt5a配体表达水平均上调[8]。因此，经典Wnt通路和非经典Wnt通路在CHF中起重要作用。

参草通脉颗粒是经过长期临床实践治疗CHF的经验方，疗效确切，试验结果证明参草通脉颗粒可明显改善患者心功能分级，提高LVEF[1]。药理学研究表明，黄芪可改善心肌舒缩功能、抑制纤维化[9]；人参可降低心肌胶原含量，减少心肌纤维化程度，延缓心室重构[10-11]；红花具有兴奋心脏作用，增加冠状动脉血流量，改善心肌缺血[12]；丹参可抑制Ca2+内流，阻止心肌肥厚信号传导[13]；益母草对心肌肥厚具有一定的抑制作用[14]；三七可提高Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性,改善离子转运,抑制心肌胶原增生[15]；葶苈子和茯苓均可利尿消肿[16-17]。

本研究结果显示，模型组大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平较正常组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），可能与机体对CHF的发生产生的负反馈现象有关，提示经典Wnt通路和非经典Wnt通路均可促进CHF的病理机制的发生。经药物干预后，参草通脉颗粒组和赖诺普利组大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平明显升高，与模型组比较差异均有统计学意义，参草通脉颗粒组效果均优于赖诺普利组。

综上所述，参草通脉颗粒通过调控经典Wnt通路和非经典Wnt通路，治疗慢性心衰疗效显著，值得临床推广应用。