添加乳酸菌、糖蜜和无机酸对羊草青贮饲料发酵品质及体外干物质消失率的影响

黄秋连 周 昕 王 健 张嘉宾 曹 阳

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心，大庆163319)

羊草(Leymuschinensis)为禾本科多年生冷季型牧草，广泛生长于亚洲北温带地区，是中国北方、蒙古高原、西伯利亚西部和东部的主要天然牧草[1]，具有适应性强、产量高、富含蛋白质等特点。目前我国大部分地区通常将羊草加工成干草产品[2]。但是，在黑龙江绝大多数地区，在羊草的收获季节，晾晒时正逢雨季，常常遭受雨淋，导致营养物质流失和发霉变质[3]，调制干草较困难，因此青贮方式是贮藏羊草更有效的措施，能避免因雨淋导致营养成分的流失[4]。但由于羊草的水溶性碳水化合物(WSC)含量较低，难以调制出优质青贮饲料，需要进行添加剂青贮。

通常在乳酸菌数量至少达到105CFU/g FM时，才能保证牧草良好的发酵品质并得以长期保存[5]。然而大多数牧草附着的乳酸菌数量均低于105CFU/g FM，因此需要添加外源乳酸菌来获得优质青贮饲料。20世纪70年代就已证明添加乳酸菌有益于青贮饲料的发酵，特别是同型发酵乳酸菌，可以确保牧草青贮以乳酸发酵为主导，从而提高牧草的发酵品质[6-7]。Cai等[5,8-9]研究表明，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Chikuso-1是一种很有潜力的全株水稻青贮乳酸菌添加剂。Cao等[10-11]报道，与对照组相比，LactobacillusplantarumChikuso-1处理的青贮饲料pH降低，乳酸含量和干物质消失率提高。李苗苗等[12]将乳酸菌添加到油莎草青贮中，可有效地改善油莎草青贮发酵品质，提高其营养价值。糖蜜可为乳酸菌提供更多的发酵底物，使乳酸发酵迅速占据主导地位，已作为一种绿色、安全的发酵促进剂被广泛使用。Alli等[13]报道，银合欢青贮过程中添加糖蜜可以降低pH，减少干物质损失，增加乳酸和水溶性碳水化合物含量。靳思玉等[14]研究显示，添加糖蜜可以提高油莎草的青贮发酵品质和黄酮含量。在新鲜牧草青贮初期，由于pH较高，并有部分氧气存在，植物表面附着的好氧性微生物活跃，消耗青贮原料中的养分[11]，因此如何迅速降低pH，抑制好氧性微生物的活性，减少养分损失，对于成功青贮至关重要。张志登等[15]研究发现，添加无机酸可提高黄贮玉米秸秆发酵品质和体外干物质消失率，减少甲烷生成量。靳思玉等[16]报道，苜蓿青贮时添加无机酸，可以抑制有害微生物的增殖，显著提高苜蓿青贮发酵品质。

本试验采用小规模发酵法，以羊草为原料，研究乳酸菌、糖蜜、无机酸作为青贮添加剂对羊草青贮饲料营养成分含量、发酵品质及体外瘤胃干物质消失率的影响，为优质羊草青贮饲料的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用羊草的供给地为黑龙江省大庆市天然草场，羊草铡短至1～2 cm，水分含量调整为60%；青贮添加剂：乳酸菌制剂(LactobacillusplantarumChikuso-1)，由日本某研究所提供，活菌数约为105CFU/g；糖蜜：由成都某商贸有限公司提供，总糖(蔗糖+还原糖)含量≥40%，波美度(°Bé)≥33.333；无机酸：由1 mol/L H2SO4和2 mol/L HCl以体积比4∶1混合而成的混合酸。

1.2 试验设计

采用单因子完全随机设计，在羊草青贮时设置5个处理：1)无添加(C组，作为对照组)；2)添加0.000 25%乳酸菌(LAB组)；3)添加4%糖蜜(M组)；4)添加4%无机酸(IA组)；5)添加0.000 25%乳酸菌+4%糖蜜(LAB+M组)。青贮添加剂的添加量均为鲜重基础，每个处理设置3个重复，将羊草与青贮添加剂混匀后装入16 cm×25 cm聚乙烯袋(每袋约200 g)，抽真空密封，室温下保存120 d后开封取样分析。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 感官品质

开封后鉴定羊草青贮饲料的颜色、气味、质地、霉变等感官品质，判定标准参考文献[17]。

1.3.2 发酵品质

1.3.3 微生物培养及计数

称取10 g羊草青贮饲料，与90 mL蒸馏水混匀过滤，在无菌操作环境中，用蒸馏水将浸出液从10-1连续梯度稀释到10-5备用。乳酸菌采用MRS肉汤培养基(30 ℃厌氧，48 h)，梭菌孢子采用Clostridia Count Agar培养基(30 ℃厌氧，48 h)，霉菌和酵母菌采用Potato Dextrose Agar培养基(30 ℃，48 h)，好氧性细菌和芽孢杆菌采用Nutrient Agar培养基(30 ℃，48 h)，大肠杆菌采用Blue Light Broth培养基(30 ℃，48 h)培养后，采用平板菌落计数法计算各菌落总数，用每克新鲜样品中菌落形成单位的对数表示[lg(CFU/g FM)][20]。所用培养基均由青岛海博生物有限公司提供。

1.3.4 体外瘤胃发酵参数

用2个装瘤胃瘘管的成年羯羊(平均初始体重32.0 kg)作为瘤胃液供体。饲料供应参照《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)，每天06:00和18:00分别饲喂1次，自由饮水[12]。饲喂后2 h经瘤胃瘘管取瘤胃液，4层纱布过滤后，以相同的体积混合转入塑料瓶。将混合后的滤液通入CO2气体，以1∶4的体积比与McDougal缓冲液(pH 6.8)混合形成瘤胃缓冲液，然后将50 mL瘤胃缓冲液转移到128 mL的含0.5 g羊草青贮饲料样品的血清瓶中，通入CO2气体排出空气。用丁基橡胶塞和铝盖将血清瓶密封后于恒温培养振荡摇床(39 ℃，100 r/min)培养48 h后，测定pH、产气量、干物质消失率[10]。所用仪器及设备均由黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室提供。

1.3.5 营养成分含量

将剩余的羊草青贮饲料于电热恒温鼓风干燥箱(65 ℃，48 h)烘至恒重后，粉碎并过2 mm筛后分析营养成分。采用AOAC(1990)[19]的934.01、976.05、920.39和942.05方法，分析干物质(dry matter，DM)、粗蛋白质(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(Ash)含量。参照Van Soest等[21]的方法，分析中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)含量。

1.4 数据分析与统计

试验数据采用Excel 2010计算与整理后，使用SAS 9.4进行方差分析，并用Tukey法进行多重比较，差异显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 羊草青贮饲料的感官品质

由表1可知，对照组的羊草青贮饲料以黄褐色为主，各添加剂组均为黄绿色；各添加剂组的羊草青贮饲料比对照组的酸味更浓；各组羊草青贮饲料总体为质地柔软、湿润不黏手、无霉变。

表1 羊草青贮饲料的感官品质

2.2 青贮前羊草及其经不同处理青贮后的营养成分含量

由表2可知，试验所用羊草青贮前DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash含量分别为34.10%、7.90%、2.23%、66.16%、29.95%和6.99%。添加不同青贮添加剂进行青贮后，M组和LAB+M组的DM含量显著高于对照组(P<0.05)；IA组的CP含量显著高于其他各组(P<0.05)；LAB+M组的NDF含量显著低于其他各组(P<0.05)；各添加剂组的ADF含量均显著低于对照组(P<0.05)；各组间EE和Ash含量无显著差异(P>0.05)。

表2 青贮前羊草及其经不同处理青贮后的营养成分含量

2.3 羊草青贮饲料的发酵品质

由表3可知，各添加剂组pH均显著低于对照组(P<0.05)，其中IA组pH最低，为4.41；LAB+M组的乳酸含量显著高于其他各组(P<0.05)；与对照组相比，所有添加剂组的氨态氮/总氮都有不同程度的下降，其中M组和IA组的氨态氮/总氮显著低于其他各组(P<0.05)；各组均未检出丁酸。

表3 羊草青贮饲料的发酵品质

2.4 羊草青贮饲料的微生物数量

由表4可知，各添加剂组的乳酸菌数量均显著高于对照组(P<0.05)，其中LAB+M组的乳酸菌数量最高；LAB组的芽孢杆菌数量显著低于其他各组(P<0.05)；M组的酵母菌数量最高，且显著高于对照组和LAB组(P<0.05)；各组间好氧性细菌数量均无显著差异(P>0.05)，且均未检出大肠杆菌、梭菌和霉菌。

表4 羊草青贮饲料的微生物数量

2.5 羊草青贮饲料的体外瘤胃发酵参数

由表5可知，各组pH无显著差异(P>0.05)；除M组外，其他添加剂组与对照组相比产气量均出现不同程度的增加，其中LAB+M组的产气量最高；LAB+M组的体外干物质消失率显著高于对照组和LAB组(P<0.05)。

表5 羊草青贮饲料的体外瘤胃发酵参数

3 讨 论

本试验中，各组羊草青贮饲料均表现为质地柔软、水分适宜、有浓厚酸味，相较于羊草原料本身，其质地和适口性得到明显改善。其中，对照组为黄褐色，各添加剂组均为黄绿色，且各添加剂组的酸香味也比对照组更浓厚，符合优质青贮饲料的感官评定标准[22]。

乳酸菌在青贮发酵中起着重要作用，乳酸菌数量已成为预测青贮饲料发酵的充分性和决定青贮饲料是否添加外源乳酸菌的重要因素。本试验所用的乳酸菌菌株为LactobacillusplantarumChikuso-1，该菌株能促进乳酸发酵，在低pH环境下生长良好[11]。因此，用该菌株制备青贮饲料可以促进乳酸菌的增殖，降低pH，抑制梭菌和其他微生物的生长，使青贮饲料的品质得以提高[5]。在本试验中，添加乳酸菌组与对照组相比，乳酸含量增加，pH显著降低，氨态氮/总氮降低，未检测出大肠杆菌、梭菌和霉菌，这是因为添加乳酸菌增加了青贮发酵初期的乳酸菌数量，弥补了原料中乳酸菌数量的不足，很快进入乳酸发酵阶段，pH迅速下降，有害微生物的活性被抑制[23]。

糖蜜所含的WSC可以被乳酸菌直接利用，添加到青贮中可以促进青贮早期乳酸菌的繁殖，快速达到稳定的青贮发酵阶段，抑制其他杂菌对发酵底物的消耗和蛋白质的水解。吴金彩等[24]添加不同水平糖蜜青贮全株“张杂谷”，结果表明4%糖蜜组的各项发酵指标较好。孙肖慧等[25]报道，紫花苜蓿和燕麦以3∶7混合后添加4%糖蜜青贮，可使丁酸含量和氨态氮/总氮显著降低。本研究结果显示，添加4%糖蜜制备的羊草青贮饲料的pH、ADF含量和氨态氮/总氮降低，CP含量增加，与吴金彩等[24]和孙肖慧等[25]研究结果一致；同时，添加糖蜜组的酵母菌数量不同程度高于其他各组，这是由于添加糖蜜后，残留的WSC和乳酸含量相对较高，而这2种物质被用作酵母菌的底物[26]。与对照组相比，添加糖蜜组的乳酸含量没有显著增加，而添加乳酸菌+糖蜜组乳酸含量显著增加，与Cao等[10]的报道一致，这可能是因为即使不添加糖蜜，羊草青贮中也有足够的可发酵糖，乳酸菌可能已经将更多的可发酵糖转化为乳酸。

酸处理可使饲料pH迅速下降，达到适于乳酸菌生长繁殖的条件，同时抑制有害菌的繁殖。张志登等[15]添加4%无机酸黄贮玉米秸秆，靳思玉等[16]添加8%无机酸青贮紫花苜蓿，结果表明4%和8%无机酸的添加均可使pH显著下降，抑制有害微生物的生长，提高青贮饲料发酵品质。本试验研究结果与上述研究结果相似，同时本试验中添加无机酸组的氨态氮/总氮显著低于对照组，CP含量显著高于其他组，这是由于pH的迅速降低有效地抑制了植物酶和微生物水解蛋白酶的活性，进而使蛋白质的降解和后期游离氨基酸的分解减少。

添加乳酸菌+糖蜜组的DM和乳酸含量显著高于其他组，这可能是由于两者的加入不仅补充了发酵底物，也增加了乳酸菌数量，促进了青贮早期乳酸菌的增殖，从而使乳酸菌能够生产更多的乳酸，使pH迅速下降，抑制有害微生物增殖，减少了营养成分的损失[27]。

瘤胃液pH可以反映瘤胃内部环境与发酵程度，微生物的活动和繁殖要求环境保持一定的pH，其正常变化范围为5.5～7.5[28]。本研究中，体外培养液的pH均处于此范围内，为6.78～7.21，不会影响微生物的活力。饲料体外发酵产气的底物主要是碳水化合物，产气量可以反映瘤胃微生物利用底物的程度，也可以体现饲料营养价值的高低[29]。程鹏辉等[30]研究表明，产气量越大，牧草发酵品质越好。体外干物质消失率反映发酵体系中微生物降解饲料的程度[12]。本试验中，羊草青贮饲料的体外产气量和干物质消失率最大的均为添加乳酸菌+糖蜜组，可见同时添加乳酸菌和糖蜜时羊草青贮饲料的发酵品质和营养价值最好。

4 结 论

本试验所使用的青贮添加剂均能在不同程度上改善羊草青贮饲料的发酵品质和体外干物质消失率，综合考虑，以同时添加乳酸菌和糖蜜的效果最好。