白藜芦醇调节卵清蛋白诱导的小鼠过敏性鼻炎的作用机制研究

李栋才，王 鹏，李 胜，于巧莲，蓝建平，程保辉

(深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院耳鼻咽喉科，深圳市耳鼻咽喉研究所，深圳市耳鼻咽喉重点实验室，广东 深圳 518172)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)属于I型变态反应性疾病，是机体受到过敏原刺激后产生的特异性免疫应答，引起鼻黏膜组织炎症和生理功能紊乱的一种疾病。据流行病学统计，全球范围内10%-40%的人口患有过敏性鼻炎[1]。基于2005-2011年过敏性鼻炎流行病学调查数据，我国过敏性鼻炎发生率为17.6%，过敏性鼻炎发生率呈现连年升高趋势[2]。目前过敏性鼻炎治疗以糖皮质激素喷鼻治疗、特异性免疫疗法(specific immunotherapy，SIT)和口服应用抗组胺、抗白三烯药物为主[3]。SIT疗法周期长，病人依从性差，治疗结果个体差异大[4]。临床中断应用抗过敏药物，过敏症会反复发作[5]。因而，寻找新的抗过敏药物或疗法已势在必行。

随着人们生活水平提高，过敏患者开始注重通过调节饮食来防治过敏，因而对植物来源、具有预防和治疗过敏的天然成分产生了浓重的兴趣[6-7]。白藜芦醇(resveratrol)具有广泛的抗过敏、抗炎、抗氧化作用，在过敏性哮喘治疗方面引起了广泛关注和讨论[8-10]，但是白藜芦醇对过敏性鼻炎的治疗作用和机制仍有待进一步研究。白藜芦醇对过敏性鼻炎的调节作用和免疫学机制的阐明，将有助于合理应用白藜芦醇预防和治疗过敏性鼻炎。本文中，我们基于卵清蛋白诱导的小鼠过敏性鼻炎模型，探讨白藜芦醇对过敏性鼻炎的治疗作用和免疫学机制，以期为应用白藜芦醇缓解鼻炎相关过敏症状提供相关研究基础。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器6周龄雌性Balb/c小鼠,体质量(20±2)g，由广东省实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号SCXK(粤)2013-0002；该动物实验通过深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院(深圳市耳鼻咽喉研究所)实验动物伦理委员会批准(编号：龙耳医动伦[2020]第0101号)，相关实验在深圳市耳鼻咽喉研究所开展。

主要试剂和仪器：地塞米松(Sigma-Aldrich中国，批号D4902)；白藜芦醇(Macklin Inc.，批号R817263)；IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)ELISA试剂盒(CUSABIO武汉华美，批号分别为CSB-E04634m、CSB-E04594m、CSB-E04602m、CSB-E04608m、CSB-E04578m和CSB-E08914m)；流式抗体APC anti-mouse CD4抗体、PE anti-mouse GATA3抗体(BD Biosciences，批号分别为553051、560074)，达优小鼠淋巴细胞分离液(深圳市达科为生物工程有限公司，批号DKW33-R0100/DKW33-R0400)，细胞固定破膜剂(eBioscience，批号88-8824-00)，BD FACSCanto II流式细胞仪(BD Bioscience，USA)，酶标仪SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices,USA)，台式高速冷冻离心机(Thermo，USA)，Nikon Eclipse Ci-L/S显微镜(Nikon,Japan)及配套的电脑端数码影像系统，Leica RM2245切片机(Leica，German)。

1.2 小鼠过敏性鼻炎模型造模6周龄Balb/c雌性小鼠(动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002)随机分为正常对照组(normal control，NC)、过敏性鼻炎模型组(allergic rhinitis，AR)、白藜芦醇低剂量治疗组(low dose of resveratrol 30 mg·kg-1，RL)、白藜芦醇高剂量治疗组(high dose of resveratrol 100 mg·kg-1，RH)治疗组、地塞米松治疗组(dexamethasone 10 mg·kg-1，Dex)，共5组，每组6只。AR模型组、RL组、RH组、Dex组于d 1、7、14，腹腔注射卵清蛋白(ovalbumin，OVA)+氢氧化铝致敏(NC组腹腔注射等体积的生理盐水)；于d 21、28、35、39分别进行OVA滴鼻激发(NC组给予等体积的超纯水)。RL组、RH组、Dex组从d 1开始，以灌胃的方式隔天给药1次(NC组灌胃给予等体积的生理盐水)。

1.3 小鼠鼻炎症状评价在末次给药后2 h，卵清蛋白溶液对小鼠鼻腔进行局部刺激，即刻将小鼠置于单独的鼠笼中，观察15 min，记录各组小鼠挠鼻和打喷嚏的次数。

1.4 小鼠血清中过敏相关细胞因子水平检测记录各组小鼠挠鼻和打喷嚏的次数后，麻醉小鼠，眼球取血，静置2 h后，1 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，取上层血清。按照IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)ELISA试剂盒操作方法，检测小鼠血清中IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、OVA-sIgE水平。

1.5 鼻黏膜组织学形态评价去除小鼠面部皮毛，取小鼠鼻部器官于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，5 μm切片，梯度乙醇脱水，进行苏木红和伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光学显微镜下分析炎症细胞浸润情况。

1.6 流式细胞术检测脾脏中Th2细胞比例参考达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离方法，分离小鼠脾脏淋巴细胞；各组小鼠脾脏淋巴细胞经固定、破膜后，进行CD4和GATA3流式抗体染色，BD FACS Canto II流式细胞仪分析各组CD4+GATA3+Th2细胞比例。

2 结果

2.1 白藜芦醇对过敏性鼻炎小鼠挠鼻和打喷嚏行为的影响于d 39，最后一次卵清蛋白激发后，将小鼠单独置于鼠笼中，观察小鼠挠鼻和打喷嚏次数。正常组小鼠卵清蛋白喷雾激发后，15min 内挠鼻次数为0.5[0,2]次，卵清蛋白诱导的鼻炎模型组中小鼠挠鼻次数上升至25.5[24,28](P<0.01)；经低剂量和高剂量白藜芦醇治疗后，挠鼻次数分别显著降低到21[19,26](P<0.05)和6[5,7]次(P<0.01)(Fig 1A)。正常组小鼠卵清蛋白喷雾激发后，15分钟内打喷嚏次数为0[0,0]次，卵清蛋白造模的鼻炎模型组中小鼠打喷嚏次数上升至10[9,12](P<0.01)；经低剂量和高剂量白藜芦醇治疗后，挠鼻次数分别显著降低到7.5[6,8](P<0.01)和3.5[3,4]次(P<0.01)(Fig 1B)。地塞米松治疗后，挠鼻次数和打喷嚏次数，相较于鼻炎模型组分别降低至5[4,6](P<0.01)和2.50[2,3](P<0.01)(Fig 1)。

2.2 白藜芦醇对过敏性鼻炎小鼠鼻黏膜组织形态的影响HE染色结果显示，正常组(NC)小鼠鼻黏膜中基本没有炎细胞浸润，卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎模型组(AR)小鼠鼻黏膜有明显红肿现象，炎性细胞浸润较为严重，白藜芦醇高剂量组(RH)及地塞米松治疗组(Dex)小鼠鼻黏膜红肿现象减轻，炎性细胞浸润状况也相应减少(Fig 2)。低剂量白藜芦醇(RL)治疗对鼻黏膜红肿和炎细胞浸润改善作用不明显。

2.3 白藜芦醇对过敏性鼻炎小鼠血清中过敏相关细胞因子水平的影响卵清蛋白诱导过敏性鼻炎模型组(AR)中，血清中IL-4(54.38±10.47，P<0.000 1)、IL-13(29.96±5.97，P<0.01)和OVA-sIgE(0.91±0.14，P<0.01)水平均高于正常组(NC)IL-4(4.70±0.57)、IL-13(2.02±0.59)、OVA-sIgE(0.04±0.01)。与过敏性鼻炎模型组(AR)比较，高剂量白藜芦醇治疗组(RH)小鼠血清中IL-4(30.09±2.46，P<0.01)、IL-13(12.49±1.25，P<0.05)、OVA-sIgE(0.55±0.08，P<0.05)水平明显降低。低剂量白藜芦醇(RL)治疗前后，IL-4(36.28±3.66)、IL-13(24.01±6.19)、OVA-sIgE(0.62±0.13)水平同过敏性鼻炎组差异无显著性。地塞米松(Dex)治疗组小鼠血清中IL-4(5.67±1.00，P<0.01)、IL-13(11.09±1.97，P<0.05)、OVA-sIgE(0.47±0.05，P<0.01)水平相较于过敏性鼻炎模型组明显降低。正常对照组、过敏性鼻炎模型组、及白藜芦醇治疗组和地塞米松治疗组，各组之间小鼠血清IL-10、IL-17和IFN-γ水平均未表现出明显区别。见Fig 3。

Fig 1 Impacts of resveratrol on nasal rubbing and sneezing behaviors in OVA-induced allergic rhinitisNasal rubbing and sneezing frequencies in allergic rhinitis group (AR) increased notably compared to normal control group (NC),and the promoted nasal rubbing and sneezing frequencies were reversed after treatment with high dose (RH) and low dose resveratrol (RL) and dexamethasone (Dex),##P<0.01 vs NC,*P<0.05,**P<0.01 vs AR,n=6.

Fig 2 Resveratrol alleviated inflammatory infiltration and improved mucosal integrity in OVA-induced allergic rhinitis mouse model

2.4 白藜芦醇对过敏性鼻炎小鼠脾脏中CD4+GATA3+Th2细胞比例的影响流式细胞术结果显示，CD4+GATA3+Th2细胞在正常组小鼠脾脏淋巴细胞中的表达水平为(7.89±1.97)%，卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎模型组中CD4+GATA3+Th2细胞比例为(12.09±3.10)%(P<0.05)，高于正常对照组。经白藜芦醇治疗后，同鼻炎模型组比较，白藜芦醇低剂量组[(4.10±2.88)%，P<0.01]和高剂量组[(3.20±1.43%，P<0.01)]中CD4+GATA3+Th2细胞比例均降低。地塞米松治疗后，小鼠脾脏中CD4+GATA3+Th2淋巴细胞CD4+T细胞中占比显著下降为[(4.08±1.50)%,P<0.01，见Fig 4]。

Fig 3 Effects of resveratrol on sera allergic cytokines in OVA-induced allergic rhinitis mice (,n=6)A:Treatment with high dose of resveratrol decreased sera levels of OVA-sIgE notably;B:Treatment with high dose of resveratrol decreased sera levels of IL-4 and IL-13 in allergic rhinitis dramatically,but no significant changes were observed in IFN-γ,IL-10 and IL-17 among NC,AR,RL,RH and Dex group;##P<0.01 vs NC,*P<0.05,**P<0.01 vs AR.

Fig 4 Modulation of resveratrol on ratio of CD4+GATA3+Th2 cells in spleen of allergic rhinitis mice (,n=6)Both the high dose and low dose treatment of resveratrol reduced the ratios of CD4+GATA3+Th2 cells significantly in spleen of allergic rhinitis mice;#P<0.05 vs NC,**P<0.01 vs AR.

3 讨论

过敏性鼻炎病理学发病机制主要涉及鼻黏膜中嗜酸性细胞浸润、肥大细胞聚集和T细胞活化[11]。Th1和Th2免疫平衡在过敏性鼻炎的发生中起到重要的调节作用，尤其是对Th2型免疫反应[12]。过敏体质的患者接触外源性过敏原时，抗原提呈细胞吞噬抗原，并将抗原进一步加工后，将特异性抗原片段提成给CD4+T细胞，导致T细胞向Th2细胞分化；Th2细胞分泌Th2型细胞因子IL-4和IL-13；其中，IL-4可促进B细胞分化为质细胞，并针对特异性抗原产生抗原特异性IgE；IL-13主要活化黏膜组织中嗜酸性粒细胞和肥大细胞。患者再次接触到过敏原时，抗原特异性IgE同过敏原迅速结合，导致IgE-FcεRI交联，进而引发肥大细胞脱颗粒，释放过敏介质，破坏黏膜组织细胞，出现黏膜水肿、分泌物增多，产生鼻痒、打喷嚏、流鼻涕等炎症症状，引发过敏性鼻炎[13-14]。在研究中，白藜芦醇治疗后明显降低极化的Th2细胞比例，同时逆转了OVA诱导上调的过敏性鼻炎小鼠血清中IL-4、IL-13和OVA-sIgE的水平，减轻鼻黏膜嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润。

Th17细胞和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的发现拓展了Th1/Th2平衡学说，进一步加深了对AR免疫学病理机制的了解[15-16]。Th17介导的中性粒细胞炎症反应在重症哮喘的作用近年来引起广泛关注，有相关报道Th17也参与鼻炎的发病过程[17]。调节型T细胞作为机体中一类具有免疫负调控功能淋巴细胞亚群，对维持机体免疫平衡、调节过敏反应具起到重要作用[18]。该研究中，OVA诱导的过敏性鼻炎模型及高、低剂量的白藜芦醇治疗组中，小鼠血清中的Th1型细胞因子IFN-γ、Th17型细胞因子IL-17和Treg型细胞因子IL-10均未表现出显著差别；白藜芦醇高剂量治疗后，可以逆转卵清蛋白诱导高表达的Th2细胞特异性转录因子GATA3和Th2型细胞因子IL-4、IL13的表达水平；上述研究结果提示，白藜芦醇主要通过抑制Th2型细胞极化和Th2型细胞因子释放，调节机体免疫，改善过敏鼻炎症状。

综上所述，白藜芦醇能够降低卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎小鼠脾脏中CD4+GATA3+Th2型T细胞比例，减少Th2型细胞因子IL-4、IL-13的释放，进而抑制B细胞针对抗原卵清蛋白生成的特异性IgE，抑制肥大细胞脱颗粒释放过敏和炎症介质，减轻鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞浸润，缓解小鼠过敏性挠鼻和打喷嚏次数，改善过敏性鼻炎症状。