米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建

毕付提，史亚楠，张久祎，王静然，薛鲜丽，2，王德培，2*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；3.江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏 镇江 212000）

米曲霉作为食品安全菌种，广泛应用于发酵食品如生产米酒、酱油等。同时由于其能分泌大量的酶，也用于淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶等多种酶制剂的生产。近年来通过基因改造，米曲霉还用于生产多种有机酸如苹果酸、曲酸等。由于米曲霉独特的代谢特征可产生多种被人类所需要的产品，已成为丝状真菌中的重要研究对象。

传统针对米曲霉的改良，一般是通过诱变的方法进行。随着分子生物学技术的发展，希望能有效地、有目的性地对米曲霉代谢产物相关基因进行针对性改造以获得更好的生产性能。抗性筛选是基因改造过程中必不可少的途径，但米曲霉自身具有较高的耐药性，很少有外源抗性标记可直接用于米曲霉的改造[1]。据报道潮霉素抗性标记hyg[2-3]，博来霉素抗性标记ble[4]曾成功用于米曲霉真菌遗传转化，但是需要额外加辅助剂氯丙嗪和曲拉通来增加菌株敏感性。即便加入辅助剂，其对潮霉素抗性达到600 μg/mL，导致筛选过程假阳性率极高。此外，成功用于米曲霉遗传转化的抗性标记还有吡啶硫胺素[5-6]、萎锈灵[7]、腐草霉素[8]，但使用浓度也高于一般丝状真菌如黑曲霉，而这些抗性标记转化筛选系统所需抗生素价格昂贵，这限制了其在米曲霉基因操作中的应用。

营养缺陷型筛选标记可通过将相应的营养缺陷基因回补进行转化子筛选。常用的营养缺陷型有尿苷/尿嘧啶营养缺陷型[9-10]，亚硝酸盐营养缺陷型[11-12]等。丝状真菌尿嘧啶核苷酸合成过程有两个关键酶，其中一个是pyrF基因编码乳清苷酸焦磷酸化酶，催化乳清酸到乳清苷酸这一步反应；另一个是pyrG基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸（orotidine-5′-monophosphate，OMP）脱羧酶，催化乳清苷酸到尿嘧啶核苷酸最后这一步反应。pyrF或者pyrG任一基因的突变或缺失都将导致尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株的产生，而将相应回补基因转入突变株可恢复为原养型。尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株必须在额外补充尿苷/尿嘧啶的培养基上才能正常生长，而野生型菌株会把5-氟乳清酸（5-fluoroorotic acid，5-FOA）转化为致死的5-氟尿嘧啶因而不能在含5-FOA的培养基生长[13]。利用这个特性，一方面可以通过5-FOA筛选获得尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株，另一方面可以用不加尿苷/尿嘧啶的培养基筛选回补原养型菌株。目前，成功获得尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株的途径有多种，例如由孢子经紫外诱变后置于添加5-FOA的培养基中进行培养[14]，或将野生型米曲霉孢子直接涂布在5-FOA平板上，适宜条件下均可获得少量营养缺陷型菌株[15]。然而随机突变获得的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株可能是pyrG突变，也可能是pyrF突变，这增加了尿苷/尿嘧啶营养回补问题的复杂性[15-16]。

本研究以米曲霉3.042为出发菌株，首先扩增米曲霉3.042的pyrG基因，并进行序列分析。尝试分别以紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因获得尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株，并验证缺陷型菌株的基因型。最后以米曲霉3.042自身来源的pyrG基因作为遗传标记回补相应营养缺陷型菌株，并成功获得回补为原养型的突变菌株。本研究为米曲霉3.042无抗性标记的遗传改造提供有效的筛选标记。

1 材料与方法

1.1 试剂、菌种和培养基

葡萄糖、NaNO3、K2HPO4、FeSO4、KCl、MgSO4·7H2O、琼脂粉（均为分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂；5-氟乳清酸、尿苷、尿嘧啶、曲拉通X-100、头孢噻肟钠、氨苄青霉素、卡那霉素（均为分析纯）：北京市索来宝科技有限公司；DL5000 DNA Maker、快速DNA聚合酶（5 U/μL）：南京诺唯赞生物科技有限公司；T4-DNA连接酶（10 U/μL）、高保真 DNA 聚合酶（2.5 U/μL）、限制性内切酶 EcoRI（15 U/μL）、HindⅢ（15 U/μL）：宝日医生物技术有限公司。

米曲霉3.042（米曲霉CGMCC 3.00951）、大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌AGL1：中国普通微生物菌株保藏管理中心，由天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究室保藏。

筛选培养基以CD培养基（配方：葡萄糖2%、NaNO30.2%、K2HPO40.1%、FeSO40.01%、KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、琼脂2%）添加0.007%曲拉通X-100，0.1%尿苷、0.1%尿嘧啶、0.2%5-FOA，筛选验证尿苷/尿嘧啶缺陷型突变株；用PDA培养基30℃培养米曲霉6 d获得新鲜成熟孢子用于诱变或基因转化；以CM培养基添加0.1%尿苷和0.1%尿嘧啶传代验证突变株遗传稳定性；以CM培养基作为pyrG回补菌株的筛选培养基；PDA培养基和CM培养基参照文献[17]配制；农杆菌转化所用IM培养基参照文献[10]配制。

1.2 仪器与设备

Mandela型多功能等离子体诱变系统：北京艾德豪克仪器生物有限公司；LRH-250A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；WXL-A30002电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ChampGel5000全自动凝胶成像仪：北京赛智创业科技有限公司；Eppendorf PCR仪：上海恒久医疗器械有限公司。

1.3 紫外诱变法获得尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变株

将PDA斜面生长6 d的孢子用生理盐水清洗，于30℃、180 r/min下孵育5 h，调整孢子浓度为107个/mL。取200 mL孢子悬液于20 W，25 mm紫外照射诱变120 s。诱变结束后立即置于黑暗处静置2 h～3 h，并涂布于筛选培养基，30℃黑暗培养3 d～5 d。待长出的转化子开始产孢，即挑取孢子分别点种在加尿苷/尿嘧啶的CM培养基和普通CM培养基再次验证。提取仅能在加尿苷/尿嘧啶培养基上正常生长的突变菌株基因组进行聚合酶链式反应验证pyrG基因，然后送到华大基因测序进一步验证，并继续用两种培养基传10代验证突变株稳定性。

1.4 pyrG敲除质粒pk5的获取

pk5质粒的构建：以p44为出发质粒，米曲霉3.042基因组为模板扩增所需片段。根据NCBI上已经公布的米曲霉RIB40乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因（pyrG）序列（AO090011000868）设计上下游引物，以米曲霉3.042基因组为模板扩增pyrG基因并送至华大测序。pyrG基因包括834 bp的CDS区和65 bp内含子。首先以F0和R0引物扩增pyrG基因片段并送至华大基因测序。以1-F和1-R引物，2-F和2-R引物分别扩增得到pyrG左侧上游同源臂pyrGL和pyrG右侧下游同源臂pyrGR。用1-F和1-R引物将两同源臂片段融合成一个片段pyrGLR。将p44质粒和片段pyrGLR用EcoRI和HindⅢ双酶切，连接获得质粒pk5，并化转至大肠杆菌。以大肠杆菌菌液为模板验证pk5质粒敲除框全长。pk5质粒用于同源重组敲除米曲霉pyrG基因。本研究所用引物均由金唯智生物科技公司合成，如表1所示。

表1 试验中用到引物Table 1 The primers used in the test

1.5 农杆菌侵染获得米曲霉营养缺陷型转化子

将pk5质粒电转化农杆菌AGL1感受态细胞，并以菌液为模板验证农杆菌。按照文献所述方法孵育农杆菌[18]，之后将农杆菌与米曲霉新鲜孢子置于IM固体培养基硝酸纤维膜上，25℃避光共培养48h。待共培养过后用无菌生理盐水将米曲霉孢子从膜上洗到添加100 μg/mL的氨苄青霉素和250 μg/mL头孢噻肟钠的筛选培养基1，30℃黑暗培养5 d～7 d。其它步骤同1.3。

1.6 转化子的恢复突变

将遗传稳定的营养缺陷型突变株作为出发菌株，用农杆菌介导的转化法，将携带pyrG回补标记基因的质粒pk1转化整合到尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株基因组上。农杆菌和孢子共培养后，洗至添加100 μg/mL的氨苄青霉素和250 μg/mL头孢噻肟钠的CM平板初筛，30℃培养2 d～3 d。初筛板长出单菌落孢子分别点种至CM培养基复筛板和5-FOA平板，30℃培养2 d～3 d至产孢，选择在CM培养基正常生长而5-FOA平板上不能生长的菌株验证pk1表达框全长，及其pyrG基因。

2 结果与讨论

2.1 米曲霉3.042 pyrG序列扩增及比对

将pyrG测序结果与米曲霉RIB40 pyrG编码氨基酸比对，序列一致性为99.64%，存在碱基差异。考虑米曲霉3.042可以在CM培养基中正常生长，推测其pyrG的突变位点不影响乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶正常表达。

为了进一步研究pyrG的丝状真菌亲缘关系，对来自不同丝状真菌的pyrG基因编码氨基酸进行进化树分析，如图1所示。

图1 米曲霉3.042 pyrG编码氨基酸及其同源蛋白的进化树Fig.1 Phylogenetic tree of pyrG from A.oryzae 3.042 with other homologs

几种米曲霉菌株pyrG编码氨基酸序列一致性最高，与其它曲霉属差异明显，与酵母菌差异显著。

2.2 诱变获得的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株验证

以诱变获得的两株稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型米曲霉O2、O11的基因组扩增pyrG，均能扩增成功。各突变菌株pyrG编码氨基酸比对如图2所示，两突变株pyrG基因编码氨基酸3’端有多个缺失，选择米曲霉O11作为出发菌株回补pyrG。

2.3 pyrG敲除质粒pk5的构建

质粒pk5的构建见图3。

图2 米曲霉突变株pyrG编码氨基酸比对（总体一致性96.87%）Fig.2 Sequence alignment of pyrG amino acids encoded by A.oryzae mutants（96.87% overall identity）

图3 质粒pk5的构建Fig.3 Plasmid construction of pk5

如图3a所示，pyrG基因上下游同源臂均成功扩增。如图3b所示，将p44质粒和pyrGLR片段用EcoRI、HindⅢ成功双酶切。连接p44质粒、pyrGLR片段以获得pk5质粒，验证如图3c所示。其中3号泳道为阳性转化子，表明pk5质粒构建成功。pk5农杆菌验证如图3e所示，由于pk5质粒不含完整pyrG基因，只能扩增出不足500 bp残余片段。

pyrG基因敲除后获得的营养缺陷型菌株可用pyrG基因作为选择标记直接进行后续的分子改造。以分子改造获得尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株较诱变获得的营养缺陷菌株主要有两个优点：一是pyrG基因编码区的大片段敲除尽可能避免自发恢复突变；二是缺陷型菌株基因型确定，可直接以pyrG基因回补而不必再鉴定出发菌株基因型是pyrG突变还是pyrF突变。

2.4 同源重组法获取尿苷/尿嘧啶营养缺陷型转化子及验证

pk5转化子的验证见图4。

图4 pk5转化子的验证Fig.4 Transformants verification of pk5

如图4a所示，pk5质粒上的pyrG同源臂同源重组替换米曲霉的pyrG基因，即获得敲除pyrG的米曲霉突变株。如图4b所示，正确的转化子才能在添加5-FOA的培养上生长。以引物1-F和2-R PCR验证转化子基因型，由图4c可知，3号泳道80号转化子有pk5表达框全长阳性条带和基因组阴性条带，为随机插入转化子。4、5、6 号泳道米曲霉 g-1、g-5、g-6 均有唯一pk5表达框全长插入，为正确转化子。由图4d进一步验证可知，米曲霉g-1 pyrG已被敲除。传10代验证米曲霉g-1遗传稳定，因此以米曲霉g-1为出发菌株进行后续pyrG回补试验。

2.5 营养缺陷型菌株的回补试验

尿苷/尿嘧啶营养缺陷型米曲霉突变株的pyrG回补验证见图5。

2.5.1 诱变来源营养缺陷型菌株的pyrG回补

以米曲霉O11为出发菌株的pk1质粒转化回补pyrG试验共进行4次，但是未能获得pyrG插入的回补转化子。如图5a部分转化子验证所示，均无pk1表达框的插入。这说明诱变得来的营养缺陷型转化子米曲霉O11即使传代验证稳定后用于共培养转化，表型仍然不稳定。另外诱变获得的米曲霉O11也可能不只是pyrG突变，还可能是pyrF等其它相关基因的突变导致的尿苷/尿嘧啶营养缺陷表型。如果是其它基因的突变，即使成功回补pyrG，米曲霉O11也无法恢复为野生型表型。将米曲霉3.042、米曲霉O11 pyrG测序结果编码的氨基酸序列于Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白三维结构预测，结果分别如图5b、5c所示。可见米曲霉O11编码氨基酸的变化未导致乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶三维结构的明显变化，因此pyrG 3’端的部分缺失可能无法引起乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活力完全丧失。

图5 pk1转化子验证Fig.5 Transformants verification of pk1

2.5.2 同源重组转化获得营养缺陷型菌株的pyrG回补

以米曲霉g-1为出发菌株的pk1质粒根癌农杆菌转化共进行3次，复筛板共计获得转化子96个，其中8个为随机插入转化子，占比8.33%。部分转化子验证pk1表达框如图5e所示，转化子不稳定可能是米曲霉孢子多核导致的。米曲霉产生的孢子大部分都是多核的，如米曲霉RIB40双核及以上多核孢子占总孢子数70%以上[19]。在发酵过程中形成多核分生孢子有助于米曲霉环境适应性，但这不利于菌种诱变筛选和基因操作。需要特别注意是以米曲霉g-1为出发菌株转化，复筛后表型为原养型的转化子大都是假阳性，即没有pk1全长插入。这一方面可能是转化子仅随机插入包含pyrG回补标记的部分片段，另一方面可能还是由于出发菌株的自发恢复突变。

由上述pyrG回补结果可见，从米曲霉3.042基因组扩增得到的pyrG回补标记可用于pyrG型尿苷/尿嘧啶营养缺陷型米曲霉恢复突变。同时证明米曲霉g-1为稳定的pyrG基因缺陷型，可直接用于基因转化。最终未能获得同源重组敲除msn2基因的转化子，表明pk1质粒转化存在诸多问题如：转化效率较低，全长随机插入转化效率仅为8.33%；筛选板上假阳性率过高。分析原因一方面可能是pk1质粒msn2同源臂长度、位置设置不合理导致转化效率低，另一方面可能是CM培养基营养丰富，其酵母粉中含少量尿苷、尿嘧啶，作为初筛平板不恰当，导致了大量假阳性。因此可以考虑使用CD培养基初筛。

3 结论

本研究表明诱变获得的米曲霉营养缺陷型菌株基因型复杂，难以直接作为出发菌株进行基因回补改造。诱变获得的营养缺陷型菌株可能需要经过复杂的验证，才能用于后续改造。另外诱变过程是否对菌株其它代谢基因有所破坏也很难验证，因此诱变并不是一种高效获得营养缺陷型的方法。

本研究以标准米曲霉3.042为出发菌株，农杆菌介导的转化法破坏米曲霉3.042的pyrG基因，获得性状稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型米曲霉g-1。之后将包含米曲霉3.042野生型自身pyrG回补基因的质粒pk1成功转化到尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株g-1中，证实米曲霉3.042 pyrG基因的回补可恢复相应缺陷型菌株为野生型。本研究充分验证米曲霉3.042自身pyrG基因可作为筛选标记直接进行基因改造，并实现以此为标记的基因操作。本试验初步建立米曲霉3.042 pyrG敲除回补标记转化体系，为之后工业米曲霉分子改造提供基础。