高效液相色谱–波长切换法同时测定独一味软胶囊中6 种成分

周颖，昝珂，郑成

（1.浙江省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，杭州 310052；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

藏药独一味来源于唇形科植物独一味Lamiophlomis rotate (Benth) Kudo 的地上干燥部分，主产于西藏、青海、云南西北部、四川西部等地，其药材来源主要依靠野生资源，属于一级濒危藏药［1-2］。独一味具有止血、镇痛消肿、活血化淤、抗菌消炎、增强免疫力等功效［3］，是我国藏、蒙古等民族常用草药之一，也是临床上常用于术后刀口疼痛、外伤骨折等的重要藏药。

独一味的主要成分有黄酮类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类3 大类，以及苯丙素类等其它成分［4-5］。独一味中的黄酮类成分具有一定的抗炎功效［6］，代表物质是木犀草苷，具有抗氧化、抗炎活性而成为独一味重要的活性成分［7］；山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯是环烯醚萜类代表性成分，具有镇痛、抗炎、止血的功效［8-9］；连翘酯苷B、毛蕊花糖苷是苯乙醇苷类物质，具有一定的镇痛活性［10］；绿原酸是苯丙素类物质，可减少炎症因子及自由基生成，进一步减轻炎症反应［11］。因此可选择山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷作为独一味主要活性成分的测定指标。

独一味软胶囊现执行国家食品药品监督管理总局国家药品标准（YBZ 02122005-2014Z-2），其相关制剂以总黄酮（以芦丁计）的含量为质控标准，采用紫外-可见分光光度法测定。目前已有文献采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定独一味软胶囊中的山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、芦丁、木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素的含量，均采用单一波长检测模式［12-15］。独一味软胶囊虽然为单方制剂，但其成分相对较为复杂，在单一波长下难以反映多种成分在最大吸收波长下的特征，因此可采用波长切换技术测定目标成分的含量。目前未见采用HPLC 波长切换技术同时测定独一味软胶囊中山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷的含量。笔者利用梯度洗脱、波长切换技术建立同时测定山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷含量的HPLC 分析方法，对6 种成分在各自的最大吸收波长下进行含量分析，提高了检测灵敏度，实现了独一味软胶囊中多指标、多成分的质量评价，为独一味软胶囊的质量评价及临床合理应用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超 高 效 液 相 色 谱 仪：Ultimate3000 型，配Chromeleon 7.2 SR5 色谱工作站、SRD-3600 型真空在线脱气机、DGP-360 型双三元梯度泵、WPS-3000TRS 型自动进样仪、TCC-3000R 型柱温箱、DAD-3000RS 型二极管阵列检测器、VWD-3400RS型可变波长检测器，美国Thermo Fisher 公司。

电子天平：XPE-2015 型，感量为0.01 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

超声仪：ELMA SONIC P 型，德国ELMA 公司。

尼龙-66 微孔滤膜：孔径为0.45 μm，天津市科亿隆实验设备有限公司。

超 纯 水 仪：Milli PAK advantage A10 型，美 国Millipore 公司。

独一味软胶囊：批号分别为20042301、20042502、20042703，购自某药业有限公司。

山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草苷对照品：纯度分别为98.3%、96.8%、90.3%、93.5%、94.4%、94.9%，批号分别为111873-201103、111753-201817、111872-201703、111811-201001、111530-201411、111720-201609，均购自中国食品药品检定研究院。

甲醇：分析纯，北京国药集团化学试剂有限公司。

乙腈：色谱纯，美国Merck 公司。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

分别精密称取山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷对照品适量，加甲醇溶解，稀释，定容，制成山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷储备液，质量浓度分别为307.09、186.34、379.44、280.69、478.04、370.60 μg／mL。

分别精密量取上述储备液适量，用甲醇稀释并摇匀，制成山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷混合溶液，质量浓度分别为61.42、18.63、18.97、56.14、47.80 、37.60 μg／mL。

1.3 样品处理

取样品内容物约0.2 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超声处理(250 W，50 kHz)1 h，放置降温，用甲醇定容至标线，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱：Symmetry Shield RP18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国waters 公司)；流量：1 mL／min；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：0～11 min 为235 nm；11～16 min 为330 nm；16～20.5 min 为235 nm；20.5～27.5 min 为330 nm；27.5～55 min 为360 nm。流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序列于表1。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

通过紫外全波长扫描山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷对照品，得到6 种待测成分的最大吸收波长分别为235、327、235、332、330、355 nm，为保证6 种成分的最高检测灵敏度，采用波长切换方法进行检测，最终选择在0～11 min 和16～20.5 min，采用235 nm检测山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯；在11～16 min 和20.5～27.5 min，采用330 nm 检测绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷；在27.5～55 min，采用336 nm 检测木犀草苷。

2.2 色谱条件的优化

对乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水系统作为流动相进行考察，结果表明乙腈-0.3%磷酸水作为流动相可使独一味软胶囊中6 种成分较好的分离，峰形尖锐且出峰稳定，故选择乙腈-0.3%磷酸水系统为流动相进行梯度洗脱，混合溶液色谱图见图1，样品溶液色谱图见图2。

图1 混合溶液色谱图

图2 样品溶液色谱图

2.3 样品前处理条件的优化

分别对称样量（0.1、0.2、0.5 g）、提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、70%甲醇）、提取时间（30、45、60、80 min）进行单因素考察。结果显示，当样品取样量为0.1～0.2 g 时，提取较为完全；加热回流60 min 与超声60 min 提取效果相当，鉴于超声方法简便易操作，故选用超声作为提取方法；山栀苷甲酯和木犀草苷在甲醇中提取效率相对较低，故选择70%甲醇作为提取溶剂；超声60 min 和80 min 提取较为完全，故选择超声60 min。综合上述结果最终确定了样品溶液的制备方法：取样品内容物约0.2 g，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超声处理(250 W、50 kHz) 1 h。

2.4 线性关系

精密吸取混合溶液各2、4、6、8、10、12 μL，按优化的色谱条件测定。以待测物的进样量（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，计算得线性范围、回归方程和相关系数，结果列于表2。由表2 可知，各化合物的进样量与色谱峰面积线性关系良好，相关系数不小于0.999 0。

表2 线性范围、回归方程、相关系数

2.5 精密度试验

取混合溶液连续进样6 次，每次10 μL，记录色谱峰面积，计算相对标准偏差，结果列于表3。由表3 可知，山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷色谱峰面积相对标准偏差为0.21%～0.69%，表明仪器精密度良好。

表3 精密度试验结果

2.6 重复性试验

称取约0.2 g 独一味软胶囊（批号：20042502），按1.3 平行制备样品溶液6 份，分别进行测定，结果列于表4。由表4 可知，每克样品中山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷分别为3.19、0.84、7.89、3.33、2.73、3.44 mg／g，其相对标准偏差分别为2.0%、1.6%、1.3%、2.1%、1.7%、2.0% (n=6)，表明提取方法的重复性良好。

表4 重复性试验结果

2.7 稳定性试验

取供独一味软胶囊（批号：20042502）按照1.3配制成样品溶液，分别在1、2、4、6、10、15、20、24 h进样，测定各化合物色谱峰面积，计算相对标准偏差。结果表明山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷相对标准偏差分别为1.17%、1.25%、1.04%、1.59%、1.48%和1.13%，结果列于表5。由表5 可知，样品溶液在24 h 内稳定性良好。

表5 稳定性试验结果

2.8 加标回收试验

精密称取约0.1 g 已知含量的独一味软胶囊样品（批号：20042502）6 份，分别精密加入山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷储备液各1、0.5、2、2、1、0.5 mL，按1.3 制备样品溶液并测定，计算加标回收率，结果列于表6。由表6 可知，6 种化合物的平均加标回收率分别为94.0%～101.1%，相对标准偏差为1.6%～2.0%，说明方法的准确性良好。

表6 加标回收试验结果

2.9 样品的测定

取3 批独一味软胶囊，按1.3 方法制备样品溶液，分别进样20 μL，并按1.4 色谱条件测定，计算各批样品中化合物的含量，结果列于表7。根据3批样品测定结果，每克独一味软胶囊内容物中山栀苷甲酯不少于3.0 mg／g，绿原酸不少于0.8 mg／g，8-O-乙酰山栀苷甲酯不少于7.8 mg／g，连翘酯苷B不少于2.4 mg／g，毛蕊花糖苷不少于1.9 mg／g，木犀草苷不少于3.4 mg／g，但各项指标的合理限度需要进一步积累数据进行规范和制定。

表7 3 批样品含量测定结果 mg／g

3 结语

建立了高效液相色谱-波长切换法同时测定独一味软胶囊中山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷含量的方法，涵盖多类活性指标成分，包括1 种黄酮、2 种环烯醚萜苷、2 种苯乙醇苷、1 种苯丙素，该方法操作简单、准确可靠、专属性好、精密度高，可为独一味软胶囊的质量控制标准提供参考。