离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐

张丽，黄选忠，杜宏山

（湖北兴山县疾病预防控制中心，湖北兴山 443711）

人的尿液中含有大量的Cl-、HPO42-、SO42-和微量的SCN-等阴离子，其中Cl-、HPO42-、SO42-是人体正常代谢产物，而SCN-是有机和无机氰化物在人体内的解毒产物，因此尿液中SCN-含量常作为人体接触氰化物的一项生物接触指标［1］。SCN-可致甲状腺肿，可阻滞甲状腺激素合成，尤其对胎儿和婴儿的智力以及神经系统发育存在较大的风险［2］，因此监测人血液、尿液等生物标本中的SCN-含量具有重要意义。目前，测定尿液中微量SCN-的方法主要有分光光度法［3-5］、衍生-顶空气相色谱法［6-7］等，其中分光光度法和气相色谱法均存在氰化物的干扰问题。

临床资料显示，约70%的尿结石为草酸钙结石，草酸代谢异常所引起的高含量草酸尿是泌尿系结石形成的主要原因［8］，因此准确测定尿液中草酸含量对研究结石形成机理、结石的鉴别等均具有重要意义。目前测定尿液中草酸的方法主要是光度法，包括络合物褪色比色法［9］和催化光度法［10-11］、催化荧光法［12-13］、高效液相色谱法［14-15］和毛细管电泳法［16］等，而比色法、光度法、荧光法等光谱分析方法特异性差，样品需进行前处理，操作繁杂，高效液相色谱法和毛细管电泳法均需要专用仪器，应用受限。

多组分同时测定历来是分析工作者所追求的目标，也是离子色谱法的优势。离子色谱法操作简便、试剂消耗少、可自动化，现已成为阴离子分析的首选方法［17］，并已应用于尿液中草酸［17-18］和SCN-［19-20］的分别测定，但用离子色谱法同时测定尿液中草酸和SCN-尚未见报道。笔者以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，10.0 mmol／L Na2CO3溶液为淋洗液，1.0 mL／min 的流量等度洗脱，建立了抑制电导检测-离子色谱法同时测定尿液中草酸和SCN-的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：CIC-100 型，青岛盛瀚色谱公司。

SPEIC-C18净化柱：1 mL，青岛盛瀚色谱公司。

电子天平：万分之一，BT214D 型，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

电子天平：千分之一，JA2003 型，上海菁海仪器有限公司。

离心机：LG10-2.4A 型，北京医用离心机厂。

滤膜过滤器：0.22 μm，青岛盛瀚色谱公司。

草酸（H2C2O4·2H2O）、硫氰酸钾：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

草酸标准溶液：1 000 mg／L，称取0.140 1 g 草酸（H2C2O4·2H2O），用高纯水溶解，定容至100 mL。

SCN-标准溶液：1 000 mg／L，称取0.167 3 g 烘干的硫氰酸钾，用高纯水溶解，定容至100 mL。

磷酸二氢钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

H2PO4-标准溶液：1 000 mg／L，称取0.140 2 g磷酸二氢钾，用高纯水溶解，定容至100 mL。

Cl-、SO42-标准溶液：均为1 000 mg／L ，编号分别为GBW(E) 080268、GBW(E) 080266，中国计量科学研究院。

无水碳酸钠、碳酸氢钠、无水亚硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

试验用水为高纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 溶液的配制

草酸、SCN-混合标准储备液：分别取适量草酸和SCN-标准溶液，用水稀释，定容，分别制备成含草酸和SCN-均为10.0 mg／L（A液）、100.0 mg／L（B液）的两种混合标准储备液。

系列混合标准工作溶液：取混合标准储备液A液0.20、0.50、1.00 mL 及B 液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00 mL 分别置于8 只10 mL 容量瓶中，加水定容至标线，混匀，配制成含草酸和SCN-均为0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、30.00 mg／L 的系列混合标准工作溶液。

亚硫酸盐（SO32-）溶液：称取0.5 g 无水亚硫酸钠于砷化氢发生瓶中，加50 mL 高纯水溶解，并向溶液中加入5 mL 10%硫酸溶液，迅速将导管插入200 mL 水中以吸收反应产生的SO2气体（可将砷化氢发生瓶置于约60 ℃水浴中），待反应完毕后取10 mL吸收液用碘量法［21］测定SO32-的浓度，储存于4 ℃冰箱备用。

模拟尿样：Cl-、H2PO4-、SO42-等是正常尿液中含量较多的几种阴离子［22］，根据其浓度，分别取相应标准溶液用高纯水稀释成含500 mg／L Cl-、300 mg／L H2PO4-和SO42-的模拟尿样备用。

1.3 仪器工作条件

分 离 柱：SH-AC-3 型（250×4.0 mm，青 岛 盛瀚色谱公司）；保护柱：SH-AC-3 型（50×4.0 mm，青岛盛瀚色谱公司）；抑制器：自再生抑制器；检测器：电导检测器；定量环体积：25 μL；自动进样器（SHA-15 型，青岛盛瀚色谱公司）；柱箱温度：35 ℃；电流：75 mA；量程：1 档；自动进样器：全定量环取样，取样后清洗（每针之间），置换量为70 μL，取样量为25 μL，扎针深度为4 mm。

1.4 标准曲线的绘制

取1.2 制备的系列标准混合工作溶液，各管取1.5 mL 于样品瓶中，启动自动进样器进样，分别测定，以草酸和SCN-的色谱峰面积（S）为纵坐标，以色谱峰面积对应的各组分质量浓度（c）为横坐标，绘制工作曲线。

1.5 尿样的采集

将聚乙烯瓶清洗干净、用高纯水浸泡后烘干备用，采集尿样50 mL 于聚乙烯瓶中储存于4 ℃冰箱中，待测定。

2.2.3 精准考核确保权责到位 加强民政和政府部门、卫生部门等协作，将基层居家养老服务项目作为街道或社区政府绩效考核的内容，并加强对农村居家养老服务意识的转变。将农村居家养老服务作为政府绩效考评的内容，从对农村居家养老服务购买的效率与服务提供的质量两方面进行考量。除此之外，还要考评辖区内居家养老服务组织数目以及服务内容落实情况等信息。从而保证考核标准的精准，促进组织的“活跃度”和可持续性发展，避免造成重硬件轻服务的“恶性竞争”。

1.6 尿样测定

取新鲜尿样经8 000 r／min 离心10 min，取上清液用高纯水稀释10 倍，然后分别用C18柱净化和0.22 μm 滤膜过滤，取1.5 mL 滤液于样品瓶中，启动自动进样器进样，测定各组分的色谱峰面积，以标准曲线法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 淋洗液的选择

以SH-AC-3 型阴离子交换柱为分离柱，以Na2CO3-NaHCO3溶液为淋洗液，取模拟尿样进行测定，考察淋洗液对各组分的分离效果。当Na2CO3-NaHCO3淋洗液的浓度配比在6∶1～6∶3 mmol／L时，均可将草酸和硫氰酸盐与尿液中的氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，各组分相对于后续组分的分离度（R）不小于1.5，但硫氰酸盐的保留时间（t）超过24 min，分析效率低下。为缩短硫氰酸盐的保留时间，提高分析工作效率，以洗脱能力较强的Na2CO3溶液进行了淋洗试验，设置流量为1.0 mL／min，试验结果列于表1。由表1 可知，当Na2CO3溶液浓度分别为8.0、10.0、12.0 mmol／L时，草酸和硫氰酸盐与尿液中的氯化物、磷酸盐和硫酸盐（当Na2CO3溶液超过8 mmol／L 时磷酸盐和硫酸盐合并为一个色谱峰）等阴离子均可完全分离，且硫氰酸盐的保留时间分别缩短至21、20 和19 min 左右。考虑到Na2CO3溶液浓度增大，相应的抑制电流也高，不利于抑制器的使用［17］，为保证适宜的分离度和较短的保留时间，选择10.0 mmol／L Na2CO3溶液为淋洗液。

表1 Na2CO3 溶液浓度对分离结果的影响

2.1.2 色谱柱的选择

以10.0 mmol／L Na2CO3溶液为淋洗液，流量为1.0 mL／min 进行等度洗脱，取模拟尿样进行测定，考察了青岛盛瀚色谱公司生产的SH-AC-1 型和SH-AC-3 型阴离子交换柱对草酸和硫氰酸盐与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子的分离情况。结果表明，在此条件下SH-AC-1 型柱虽能将草酸与常见阴离子完全分离，但硫氰酸盐在90 min 内尚未出峰；而SH-AC-3 型柱不但可将草酸和硫氰酸盐与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，且硫氰酸盐的保留时间小于21 min。故本实验选择SH-AC-3 型阴离子交换柱为分离柱。

2.1.3 淋洗液流量的选择

淋洗液浓度相同，流量不同时，组分的分离度和保留时间会发生改变。考察10.0 mmol／L Na2CO3为淋洗液，不同流量时草酸和硫氰酸盐与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等阴离子的分离效果，试验结果列于表2。由表2 可知，当淋洗液流量从0.8 mL／min 增加至1.2 mL／min 时，氯化物、磷酸盐和硫酸盐、草酸和硫氰酸盐的保留时间逐渐变短，分离度逐渐下降，但氯化物、磷酸盐和硫酸盐、草酸的分离度远大于1.5 达到完全分离的标准。在保证待测组分与干扰离子完全分离的前提下尽量使用较低的流量，以减少系统压力，因此淋洗液流量选定为1.0 mL／min。

表2 不同Na2CO3 淋洗液流量试验结果

2.1.4 柱箱温度的确定

考察了柱温分别在30、35、40 ℃时各组分的分离效果，结果显示，在所选温度下，草酸和硫氰酸盐均能与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全的分离，且随着柱温的升高组分的保留时间稍微缩短，分离度逐渐下降，草酸的色谱峰面积随着柱温的升高而增长，从30 ℃上升35 ℃，增长10%左右，从35 ℃上升40 ℃，增长6%左右；硫氰酸盐的色谱峰面积随着柱温的升高基本保持不变。在保证适宜的保留时间和较高的分离度的情况下，尽量采用较低的柱温，本试验确定柱箱温度为35 ℃，这也是色谱柱使用说明书推荐的使用温度。

2.2 线性关系与检出限

按照1.2 配制系列混合标准工作溶液，测定各管的色谱峰面积，以色谱峰面积（S）为纵坐标，以各组分的质量浓度（c）为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。

测定仪器30 min 的基线噪声，以3 倍基线噪声除以标准曲线的斜率（3N／b）计算草酸和硫氰酸盐的检出限。

其线性范围、回归方程、相关系数（回归曲线的截距、斜率和相关系数由仪器软件给出）、检出限列于表3。由表3 可知，草酸和硫氰酸盐的质量浓度在0.20～30.0 mg／L 范围内与色谱峰面积线性良好，线性相关系数分别为0.999 29、0.999 49，检出限分别为0.04、0.03 mg／L。

其中，含10.0 mg／L 草酸和硫氰酸盐标准溶液色谱图见图1。

表3 草酸、SCN–线性范围、线性方程、相关系数

图1 标准溶液色谱图

2.3 共存阴离子及抗坏血酸的影响

由于尿液中含有大量的有机物和氯化物、磷酸盐和硫酸盐等阴离子，尿样通过C18柱的净化可以消除有机物的影响，尿液经10 倍稀释以降低氯化物、磷酸盐和硫酸盐的影响。考察了氯化物等3 种阴离子对草酸和硫氰酸盐测定结果的影响，结果表明，氯化物、磷酸盐和硫酸盐的保留时间远小于草酸和硫氰酸盐的保留时间，且500 mg／L Cl-、300 mg／L H2PO4-、SO42-（H2PO4-、SO42-完全分不开合并为一个峰）不影响50 mg／L 的草酸、3 mg／L 的硫氰酸盐的测定，分离色谱图见图2。

图2 常见阴离子与草酸和硫氰酸盐分离色谱图

尿液中可能含有抗坏血酸，在碱性条件下，抗坏血酸易发生降解反应，而草酸是抗坏血酸的降解产物之一，可能会影响草酸的准确测定，有研究显示在15.0 mmol／L NaHCO3溶液(pH=8.3)中40 mg／L 的抗坏血酸在80 min 内未降解为草酸［17］，本试验使用10.0 mmol／L Na2CO3溶液（pH≈11.1）为淋洗液，pH 值远大于8.3，样品从进样到草酸出峰超过11 min，这段时间尿液中的抗坏血酸可能降解生成草酸而影响测定。观察用纯水配制30 mg／L的抗坏血酸的降解情况，结果表明本试验条件下30 mg／L 的抗坏血酸降解产生约0.3 mg／L 的草酸。试验采用亚硫酸盐（SO32-）抑制抗坏血酸的降解，这与在易氧化药物制剂中加入亚硫酸盐以提高药物稳定性的方法原理相似。

试验结果显示，50 mg／L 的SO32-可抑制30 mg／L 抗坏血酸的降解，且至少在120 min 内30 mg／L 抗坏血酸对10.0 mg／L 的草酸的色谱峰面积与峰高无明显影响（增加值＜5%）。同时50 mg／L 的SO32-对草酸和硫氰酸盐的测定结果无明显影响（误差＜5%）。

2.4 加标回收试验

取3 份1.5 mL 样液于样品瓶中，按1.6 步骤操作，测得草酸和硫氰酸盐的含量。在3 份尿样中分别添加2.0、5.0、10.0 mg／L 的草酸和硫氰酸盐，平行测定5 次，并计算草酸和硫氰酸盐的回收率及测定结果的相对标准偏差，结果见表4。由表4 可知，3 份尿液草酸和硫氰酸盐的测定结果分别为4.71～14.83 mg／L 和0.21～0.72 mg／L，加 标回收率分别为95.0%～101.1%和95.5%～100.5%，测定结果的相对标准偏差分别为1.34%～2.06%和1.56%～2.91%。尿液的加标色谱图见图3。

表4 加标回收试验结果

图3 尿液及其加标（尿液加5 mg／L 草酸和硫氰酸盐）色谱图

3 结语

建立了抑制电导检测-离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐的分析方法。该方法具有良好的重现性和准确性，操作简便快速，尿样通过C18柱的净化可以消除有机物的影响，尿液稀释10倍后可降低氯化物、磷酸盐和硫酸盐的影响。该方法以自动进样器进样，降低检验人员的工作强度，提高了工作效率，适用尿液中草酸和硫氰酸盐的同时测定。