牛粪高温堆制过程中细菌和真菌多样性变化分析

岳寿松，张玉凤，边斐，张燕，陈高，朱友峰，王翠萍

（1.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院农业资源与环境研究所，山东 济南 250100）

畜禽粪便是规模化养殖业的主要废弃物，处理不当会成为重要的环境污染源。高温堆制是粪便无害化转化的重要途径［1-3］。堆肥腐熟主要是由微生物参与的生理生化过程，在微生物驱动下，完成畜禽粪便有机质的生物降解和转化［4］。相对于自然发酵，通过添加筛选的功能菌可以改善堆肥中原始微生物种群结构，促进木质纤维素降解，显著加快堆肥腐熟进程，缩短发酵周期并提高降解效率［5，6］。

微生物多样性变化是粪便高温堆制不同阶段的重要特征。研究堆肥过程中微生物群落代谢特征，对揭示有机物降解机制及堆肥条件的优化具有重要理论意义和实践价值。王秀红等［7］利用宏基因组技术研究了好氧堆肥细菌群落结构，发现细菌菌群的种类和丰度存在多样性。方华舟等［8］利用平板培养法研究牛粪好氧堆肥期间微生物特点，发现细菌是发酵过程中的优势微生物，中温性细菌是升温阶段主要作用菌群，嗜热放线菌及嗜热细菌是高温阶段优势菌群，霉菌是降温阶段优势菌群。王亮［9］研究表明，牛粪自然好氧发酵过程中细菌类是优势菌群，多样性指数大于2.1；真菌类微生物在降温期持续增加，是中后期的优势群体，对纤维素分解起决定性作用。

已有研究大都利用传统培养方法，或利用DGGE及高通量测序技术，分别对细菌或真菌进行分析，对高温堆肥过程中细菌和真菌群落联合分析、系统研究报道较少。本研究采用高通量测序技术，分析牛粪高温堆肥过程中不同阶段物料中细菌和真菌种类与相对丰度变化及演替特点，对于理解牛粪堆肥过程、提高堆肥效果、开发新型堆肥菌剂均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

堆肥材料：新鲜牛粪、玉米秸秆粉和糠醛渣。微生物发酵菌由山东省农业科学院生物技术研究中心研制，主要成分为枯草芽孢杆菌和米曲霉孢子混合物，活菌和孢子含量100亿/克。添加量为每吨物料500克。试验材料基本理化性质见表1。发酵物料碳氮比（C/N）调整为30∶1，初期含水量为60%，pH值7.2。

表1 堆肥材料的基本理化性质

1.2 试验方法

采用槽式发酵工艺。玉米秸秆粉碎长度小于2 cm，粪便与粉碎好的辅料混合，调节水分至60%，加入微生物接种剂，充分搅拌混匀，送至发酵槽中。堆成高1.2 m、宽2 m、长3 m的条垛，3次重复。

每天上午9∶30—10∶30测定条垛表层下30 cm温度，同时记录周围环境温度。物料温度高于60℃进入高温期，每2天翻堆，维持温度70℃左右；物料温度下降到50℃以下，停止翻堆，进入降温期；物料温度降到略高于环境温度为熟化期。分别于升温期（IM，物料入发酵池1～3 d）、高温期（TH）、降温期（CO）、熟化期（MA）进行取样。取样方法：于每个条垛表层下30 cm取5个点，混合均匀；3个重复的样品再次混合均匀，立即置于-18℃冰柜保存。

1.3 DNA提取与测序

采用深圳华大基因科技有限公司Illumina平台Hiseq进行16S rRNA和ITS测序（pairedend）。提取样品基因组DNA，对检测合格的样品构建文库。设计合成含有测序接头的双index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的amplicon片段，用合格的文库进行cluster制备和测序。用下机得到的数据进行相应的生物信息分析。下机数据滤除低质量的reads，剩余高质量的clean data用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；拼接的tags经过优化后，在97%相似度下用QIIME软件将其聚类为用于物种分类的OTU（operational taxonomic units），利用QIIME软件计算样品Chao1指数、Shannon指数、phylogenetic diversity（谱系多样性）的alpha多样性值，经过UniFrac算法利用系统进化信息比较样品间物种群落差异［10，11］。

2 结果与分析

2.1 物种分类和相对丰度分析

2.1.1 OTU数及相对丰度分析 OTU代表样品物种丰富程度。细菌16S rRNA测序结果（表2）显示，升温期（IM）、高温期（TH）、降温期（CO）和熟化期（MA）样本共产生965个OTU。CO期和MA期细菌物种丰富度比IM期和TH期高80%以上，说明物料经高温转化后，更有利于细菌的生长和繁殖。

真菌ITS测序结果（表2）显示，IM、TH、CO和MA期样本共产生164个OTU。TH期比IM期的OTU数增加了29.2%，MA期比CO期增加31.1%。说明高温伴随真菌相对丰度的增加，而在熟化期真菌物种相对丰度又有较大幅度增加，与细菌表现明显不同。

表2 不同发酵时期样品OTU数

2.1.2 Core-Pan OTU分析 利用Core-Pan OTU分析，统计样品间或组间共有和特有OTU数目。16S rRNA各时期共有的OTU个数为290，占样品总OTU数的30.1%；IM 期特有的OTU 31个、TH 期9个、CO期58个、MA期42个（图1A）。ITS各时期共有的OTU个数为21个，占样品总数的12.8%。IM期特有的OTU 11个、TH期28个、CO期7个、MA期26个（图1B）。上述结果表明，细菌与真菌的多样性和演替模式不同，细菌共有的OTU占总数量的比例较高，特有的OTU相对较少，说明细菌种群相对稳定；真菌共有的OTU占总数量的比例较低，各时期特有的OTU个数相对较多，说明伴随物料高温堆制进程，真菌种群演替更剧烈。

图1 不同时期的Core-Pan OTU图

2.1.3 微生物种群多样性差异 Chao1指数越大说明物种总数越多，Shannon指数越大说明物种多样性越高，Simpson指数越大物种多样性越低。16S rRNA测序结果（表3）表明，CO期和MA期的Chao1指数和Shannon指数比IM期和TH期高，Simpson指数较低，表明物料经过高温发酵，细菌的物种数量增加，且种类更丰富。

表3 不同发酵时期样品16S rRNA和ITS种群多样性

ITS测序结果（表3）表明，TH 期、MA期Chao1指数比IM期和CO期高，表明高温期和熟化期真菌的物种数量增加。TH期和MA期Shannon指数也增加，说明高温期和熟化期具有更高的真菌物种多样性。真菌种群数量的增加是物料温度升高的重要影响因子，熟化期间丰富的养分可能更有利于真菌生长，从而增加了真菌的相对丰度。

2.2 物种注释及其相对丰度分析

2.2.1 门水平群落组成分析 IM期、TH期细菌优势菌门（相对丰度大于1%）均有4种，各菌门的相对丰度不同；CO期和MA期细菌优势菌门明显增多，分别为9种和8种，说明降温期和熟化期细菌多样性增加。与IM期相比，TH期、CO期和MA期Actinobacteria（放线菌门）相对丰度大幅度提高，分别提高14.8、7.4、22.8个百分点；Bacteroidetes（拟杆菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）相对丰度明显降低，Bacteroidetes相对丰度分别降低13.8、20.5、20.6个百分点，Firmicutes相对丰度分别降低8.7、10.0、12.0个百分点（表4）。放线菌在堆肥高温期是分解木质素、纤维素的优势菌群［12］。拟杆菌属是粪便中的主要微生物，其相对丰度降低，说明粪便经高温发酵转化成腐殖质，与其生境转化有关。

表4 细菌门水平优势菌群

真菌ITS测序结果（表5）表明，TH期、CO期和MA期的Ascomycota（子囊菌门）相对丰度均比IM大幅度增加，分别增加30.8、71.6、61.7个百分点。TH期的Zygomycota（接合菌门）和Basidiomycota（担子菌门）相对丰度比IM亦有大幅度增加，分别增加33.4、9.4个百分点。Ascomycota、Basidiomycota在自然界中与动植物残体如木材、食品、皮革等腐解有关，Zygomycota可以产生丰富的酶和代谢产物［13-15］。高温期子囊菌门、接合菌门和担子菌门相对丰度大幅度提高对物料快速腐解具有重要作用。

表5 真菌门水平优势菌群

2.2.2 属水平群落组成分析 各时期优势细菌群（相对丰度大于1%）数量不同，IM 期和CO期均有14个属，MA期13个属，TH期10个属（表6），各时期优势菌群种类差异很大。IM期的有害致病菌包括Pedobacter（土地杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Psychrobacter（嗜冷杆菌属）等，其相对丰度很高，可能是未腐熟的粪便中自然存在的。TH期、CO期和MA期上述菌群大幅度下降或消失，说明高温过程实现了物料无害化。TH期与IM 期比较，Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）、Pseudoxanthomonas（假黄色单胞菌属）、Thermovum（嗜热菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属）相对丰度大幅度提高，表现出明显的产热和物质转化特点。与IM期比较，CO期和MA期优势菌群除Pseudoxanthomonas大幅度升高外，还有高丰度的Actinomadura（放线菌属）和Streptomyces（链霉菌属），均为生境中重要的微生物，能产生酶、维生素和有机酸等，可促进有机物质降解转化和增加土壤养分［12、16］。

与IM期相比，TH期真菌属的优势菌明显增多，其次是MA期（表7）。TH期和MA期优势菌群包含产生高温和物质转化功能的菌，如引起多种物质降解和霉腐功能的Aspergillus（曲霉属），具有降解纤维素和生防功能的Chaetomium（毛壳属），能产生热稳定的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、淀粉酶的Humicol a（腐质霉属），粪便常分离到的具有腐生功能的Ascobolus（粪盘菌属），具有漆酶分泌功能的Coprinopsis（鬼伞属）等，在牛粪和秸秆高温腐熟过程中均具有重要作用［17-19］。

2.3 菌群结构的聚类（热图）分析

2.3.1 门水平聚类分析 利用热图对不同时期物料细菌和真菌群落组成进行相似性和差异性分析。细菌门水平物种热图（图2A）表明，IM 期和TH期物种组成和相对丰度最相似，CO期和MA期物种组成和相对丰度最相似。说明细菌菌群演替明显分为两个阶段。真菌门水平物种热图（图2B）表明，CO期和MA期物种组成和相对丰度最相似（距离最近、枝长最短），TH期与其它阶段的物种组成和相对丰度差异很大。

表6 细菌属水平优势菌群

表7 真菌属水平优势菌群

2.3.2 属水平聚类分析 细菌属水平物种热图（图3A）表明，CO期与MA期物种组成和相对丰度最相似（距离最近、枝长最短），TH期与其它阶段的物种组成和相对丰度差异很大。真菌属水平物种热图（图3B）表明，MA期与CO期物种组成和相对丰度最相似（距离最近、枝长最短），TH期与IM期物种组成和相对丰度最相似。

图2 细菌（A）和真菌（B）门水平物种相对丰度热图

图3 细菌（A）和真菌（B）属水平物种相对丰度热图

3 讨论与结论

本试验采用高通量测序技术研究了添加功能菌剂条件下牛粪高温堆制过程中细菌和真菌的种群变化。16S rRNA测序结果表明，4个阶段样本共产生965个OTU；ITS测序结果表明，4个阶段样本共产生164个OTU。细菌OTU数量为真菌的5.9倍，表明牛粪高温堆制期间细菌为主导菌群。细菌OTU分析结果表明，降温期（CO）和熟化期（MA）细菌物种数量和种类比升温期（IM）及高温期（TH）明显提高，说明物料经高温后更有利于细菌的生长繁殖。真菌TH期和MA期种类和数量比IM期和CO期多，说明细菌和真菌的演替模式不同。高温期真菌数量和种类大幅度增加，其菌丝的物理作用以及各种胞外酶均会促进堆肥的发酵［15］。热图分析表明，细菌属水平CO期和MA期聚为一簇，真菌表现了相同的结果。说明进入降温期和熟化期物种趋于相对稳定。研究还发现，细菌各时期共有的OTU占总数量的比例为30.1%，而真菌共有的OTU占总数量的比例为12.8%，说明不同堆制阶段细菌种群相对稳定，真菌种群演替更剧烈。

细菌高温期的优势菌群组成有明显特点，Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）、Pseudoxanthomonas（假黄色单胞菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Thermovum（嗜热菌属）相对丰度大幅度提高。鞘氨醇杆菌具有降解纤维素功能，其相对丰度增加，有助于粪便物料中纤维素的降解；假黄色单胞菌属菌株常用于生物防治，对污染物降解也具有很好的作用，其相对丰度提高，可提升发酵物料的功能；嗜热菌属高温期相对丰度增加，有利于物料高温发酵［20，21］。本研究发酵牛粪高温菌剂为芽孢杆菌，其相对丰度大幅度提高，与高温期大量繁殖有关。Pedobacter（土地杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）和Psychrobacter（嗜冷杆菌属）大多数为有害菌，高温发酵后相对丰度极低甚至检测不到，说明高温发酵可实现物料无害化。MA期Actinomadura（放线菌属）和Streptomyces（链霉菌属）丰度提高，两者是土壤生境中最重要的菌，能产生多种酶 （蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶）、维生素和有机酸等，具有促进有机物质降解和增加土壤养分的功能［22］。

真菌属数量在高温期和熟化期明显增多。其中Aspergillus（曲霉属）能引起多种物质降解和霉腐，Chaetomium（毛壳属）具有降解纤维素和生物防治功能，Humicol a（腐质霉属）能产生热稳定的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、淀粉酶，还有存在于牛粪、腐叶中的腐生菌Cephaliophora（头梗霉属）、Ascobolus（粪盘菌属），具有漆酶分泌功能的Coprinopsis（鬼伞属）等，在牛粪和秸秆高温腐熟过程中均具有重要作用［13，14］。

综上所述，各发酵阶段细菌种群和数量远高于真菌。高温期具有物质降解和转化功能，真菌种类及数量明显增加，说明真菌对物料温度升高和腐熟过程起重要作用。高温期细菌优势种群具有嗜热、降解结构物质、产生抗菌物质的功能特点，有害菌的消失主要发生在高温期。后续将研究微生物种群代谢组学机理，为高温堆制生产功能有机肥提供理论和技术支撑。