MiR-181b-5p在胃癌中的表达及生物信息学分析

李晓晴，冯 新，陈雪诺，马 战，姜 政

(重庆医科大学附属第一医院消化内科，重庆 400016)

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率一直居高不下。由于缺乏肿瘤标志物和特异性的症状与体征，早期诊断以及早期治疗存在一定的困难。尽管近年来胃癌的诊断和治疗取得了很大进展，但由于肿瘤的复发和转移，胃癌患者的预后仍然较差。目前，肿瘤血清标志物如癌胚抗原(CEA)、胃蛋白酶原、幽门螺杆菌抗体以及胃镜和组织病理学检查是用于诊断和评估疾病的主要手段，但这些诊断方法对早癌的检出率较低[1]。因此，寻求可用于胃癌早期检测和大规模筛选的生物标志物显得尤为重要。

微小RNA(miRNA)是具有17～25个核苷酸的内源性非编码调节RNA，其在转录后基因调节中起重要作用[2]。由于miRNA存在于涉及肿瘤的基因组区域中，故越来越被认为是肿瘤诊断和预后的潜在生物标志物。近年来发现，miRNA在肿瘤中发挥致癌或抑癌作用。有研究发现，miR-181b-5p参与神经胶质瘤[3]、肝癌[4]、结肠癌[5]、肺癌[6]、胰腺癌[7]等多种癌症的发生与发展。然而，有关miR-181b-5p在胃癌中的表达和作用机制却罕有报道。

GEO(Gene Expression Omnibus)是由美国国立生物技术信息中心(NCBI)创建并维护的基因表达数据库，是当今最大、最全面的公共基因表达数据资源。本文通过GEO数据库的miRNA芯片数据，结合统计学和生物信息学分析方法，研究miR-181b-5p在胃癌中的表达情况，并初步探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料：在GEO 数据库(Gene Expression Omnibus,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索并下载胃癌的 miRNA 数据，检索词为“gastric cancer”，“microRNA”。纳入标准：①胃癌的miRNA数据物种为人类；②有肿瘤组和正常对照组；③样本数量超过2例；④样本数据可以用来计算。排除标准：①样本为血液或腹水的；②样本是胃癌细胞系的；③样本中无miR-181b-5p相关数据；④样本中有其他干扰因素。

1.2方法

1.2.1数据提取和统计学处理：下载miR-181b-5p的表达数据，用SPSS 23.0分析数据，采用独立样本t检验，绘制ROC曲线来检验miR-181b-5p的诊断价值。Review Manager 5.3进行Meta分析，卡方检验和I2检验用于判断数据的异质性，若I2<25%，表明异质性较小；25%≤I2<50%，表明异质性中等；P<0.05或I2≥ 50%，表明异质性高。若异质性小或中等，使用固定效应模型分析；若异质性大,使用随机效应模型分析。绘制森林图检验数据有无偏移，P<0.05表示差异有统计学意义。

1.2.2生物信息学分析：采用MirDB[8]、miRWalk[9]、Pictar[10]、TargetScan[11]、Mirtarbase[12]、DIANAmicroT[13]预测miR-181b-5p的靶基因，预测的结果取交集，纳入至少被三个平台预测到的靶基因，从而减少软件预测的假阳性率。对全部纳入的潜在靶基因用DAVID在线工具[14]进行GO功能和KEGG通路分析。

2 结果

2.1数据收集及统计分析结果：从GEO数据库中收集到5个miRNA芯片数据集：GSE28700、GSE30070、GSE54397、GSE78091、GSE93415，表达数据均已经过标准化处理，结果见图1，其中GSE30070、GSE54397、GSE93415数据集中胃癌组织的miR-181b-5p表达水平均值高于正常组织，且差异有统计学意义(P值分别是P=0.0455、P=0.0027、P<0.001)。3个数据集的ROC曲线见图2，从GSE30070、GSE93415数据的ROC曲线可以看出，miR-181b-5p对胃癌有一定的诊断价值。

图1 5个GEO数据集中miR-181b-5p在胃癌组织和正常组织的表达水平

图2 3个GEO数据集中miR-181b-5p的ROC曲线

2.2Meta分析结果：对5个miRNA芯片数据集中miR-181b-5p的表达数据进行meta分析，异质性检验示P<0.05，I2=83%，异质性大,应用随机效应模型分析，SMD(标准±均数差)为 1.09(95%CI:0.29～1.89，P<0.0001)，Meta分析显示胃癌和正常胃组织的 miR-181b-5p的表达水平有差异，差异有统计学意义(P=0.008)。图3为绘制的森林图。

图3 miR-181b-5p在胃癌和正常胃组织中表达水平的森林图

2.3生物信息学分析结果： 通过6个miRNA靶基因预测平台结果取交集后，共得到145个miR-181b-5p潜在的靶基因。各项结果见表1。GO功能分析结果表明，靶基因的功能主要为转录的调控、细胞增殖和细胞周期的调节、蛋白质结合的调节等方面，差异有统计学意义(P<0.05)。KEGG通路分析表明，靶基因主要涉及的生物学通路为：背腹轴形成、肿瘤miRNA、雌激素信号通路、神经营养蛋白信号通路、Fox O信号通路、MAPK信号通路、肿瘤的中心碳代谢、HTLV-I感染等，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 GO功能和KEGG通路分析结果各项预测的前10项

3 讨论

胃癌是由于多个基因发生不同遗传变化而导致的多步骤的结果。由于缺乏高灵敏度和非侵入性的生物标志物，导致胃癌的诊治和预后未得到明显改善[15]。尽管许多研究一直在不断地探讨胃癌发生、发展的机制，但具体的分子机理仍未完全阐明。为了更深入地了解胃癌的分子机制，从miRNA层面分析其调控的生物学过程和功能，对肿瘤的诊治有重要意义。miRNA可以通过分泌外泌体颗粒从癌细胞释放到体液中，如血清、血浆、尿液、羊水和胃液等[16]，这可以保护它们免受核糖核酸酶(RNase)的降解。在一定的生理状态下，来源于不同细胞的miRNA在体液中会有不同的表达模式[16-17]。因此，miRNA可能是诊断胃癌有效的非侵入性生物标志物。

miR-181b-5p在许多癌症中的基因表达、分子调控等方面都发挥着重要的作用。Shi L等人的研究[3]指出，miR-181b-5p作为肿瘤抑制因子触发生长抑制，诱导细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞的侵袭，异常下调的miR-181b-5p可能是导致人神经胶质瘤的关键因素。Wang B.指出上调的miR-181b-5p会促进肝癌的生长、迁移和侵袭[4]。Nakajima G等人发现miR-181b-5p在结肠癌组织中过表达，通过调控细胞信号传导和细胞周期控制等方面促进肿瘤的发生、发展[5]。Tian F等证明miR-181b-5p在肺鳞状细胞癌中负调控RASSF1和PIK3R1的表达，而RASSF1和PIK3R1直接参与非小细胞肺癌的发生[6]。Tomihara H等人的研究[7]表明，ETS1是miR-181b-5p的靶标，与胰腺导管腺癌的预后有关。关于miR-181b-5p在胃癌中的表达和机制的研究却少有文献报道，国内的一项研究报道了对12例胃癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织进行微阵列研究，结果表明miR-181b在胃癌组织中异常过表达[18]。同样的，还有一项国内研究也通过RT-PCR法检测了46例胃癌患者、27例胃癌前病变患者及21例健康人外周血浆中miR-181b的表达水平，结果表明在胃癌和胃癌前病变患者中miR-181b表达明显增加[19]。但是在另一项研究中，miR-181b在胃癌细胞中的表达水平明显低于正常组织细胞，差异有统计学意义[20]。这些研究表明，目前关于miR-181b-5p与胃癌的关系和作用机制尚不明确，仍需进一步的探索。

本研究通过在GEO数据库中检索含有miR-181b-5p的数据集，比较miR-181b-5p在胃癌组织和正常组织中的表达水平，用统计学分析和Meta分析方法，发现胃癌和正常胃组织的 miR-181b-5p的表达水平有差异，差异有统计学意义(P=0.008)，表明对miR-181b-5p胃癌有一定的诊断价值。同时结合多个靶基因预测平台得到145个miR-181b-5p的靶基因，尽可能减少预测的假阳性。对靶基因进行GO功能分析，得到靶基因主要富集在转录的调控、细胞增殖和细胞周期的调节、蛋白质结合的调节等方面；KEGG通路分析显示其主要涉及背腹轴形成、肿瘤miRNA、雌激素信号通路、神经营养蛋白信号通路、Fox O信号通路、MAPK信号通路、肿瘤的中心碳代谢等。本研究结合多个GEO数据集进行分析，结果较为可靠，这为胃癌的诊治提供了一些新的思路。但仍存在一些不足，如纳入miRNA数据集的异质性较大、芯片测序及标准化处理的方法不同、需要进一步的实验来验证结果等。

总之，miR-181b-5p的上调与胃癌有密切的联系，对胃癌的诊断可能有重要的意义，未来需要更多多中心、大样本的实验来进一步验证。