太白韭对金黄色葡萄球菌的抑制作用

潘振东，李 璐，薛梦莹，张华峰，3，4*

（1 陕西师范大学食品工程与营养科学学院 西安710119 2 中俄食品与健康科学国际联合研究中心 西安710119 3 西北濒危药材资源开发国家工程实验室 西安710119 4 陕西省汉阴县富有机硒食品科技创新试验示范站 西安710119）

百合科葱属植物是重要的香料、蔬菜、医药来源[1-3]。本实验室研究人员发现，韭菜（Allium tuberosum）、大葱（Allium fistulosum）和小葱（Allium ascalonicum）的水提物与乙醇提取物皆具有自由基清除活性，其中韭菜的抗氧化能力最强[1]。Meriga 等[4]研究发现，大蒜（Allium sativum）水提物和甲醇提取物能够抑制枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）的生长。Khalid 等[3]研究证明，韭菜水提物对枯草芽孢杆菌的抑制活性略高于大蒜水提物。Behbahani 等[5]研究发现，部分葱属植物精油对酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、白色念珠菌等具有一定的抑制作用。太白韭（Allium prattii） 是秦巴山区的特色药食同源植物，既可入药，也可作为野菜或香料食用[6]。然而，迄今未见有关太白韭抑菌活性的研究报道。本研究分析了太白韭乙醇提取物对食源性致病菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用，采用原子吸收光谱法、扫描电子显微镜技术等探讨其抑菌机理，分析其化学组成，以期为太白韭资源的开发利用和金黄色葡萄球菌抑菌剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与植物材料

金黄色葡萄球菌CICC23656 菌株，中国工业微生物菌种保藏管理中心。太白韭样品，于2017年采自陕西省渭南市秦岭山区。将太白韭叶片分拣除杂，用自来水、蒸馏水依次漂洗，置通风处阴干后，粉碎过筛（80 目），制得太白韭样品粉末，备用。

1.2 主要试剂

牛肉膏蛋白胨培养基、营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（BR 级），北京奥博星有限责任公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（BR 级），青岛海博生物技术有限公司；大蒜素（allicin，纯度≧98%）、蒜氨酸（alliin，纯度≧98%）、尿苷（uridine，纯度≧98%）、β-胸苷（β-thymidine，纯度≧98%）、腺苷（adenosine，纯度≧98%）、2'-脱氧腺苷（2'-deoxyadenosine monohydrate，纯度≧98%）、芦丁（rutin，纯度≧98%）、山柰酚（kaempferol，纯度≧98%）、槲皮素（quercetin，纯度≧98%）和异鼠李素（isorhamnetin，纯度≧98%），美国Sigma 试剂公司；碱性磷酸酶检测试剂盒、红四氮唑（纯度≧99%）、氨苄青霉素钠（USP 级），上海源叶公司；钾（K+）、钙（Ca2+）、钠（Na+）、镁（Mg2+）标准离子液，天津傲然精细化工研究所；邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG，纯度≧99%），上海阿拉丁有限公司；甲醇（色谱纯级）等，德国Merck 公司。

1.3 仪器与设备

JPCQ0328 型全数字式超声波清洗机，武汉嘉鹏公司；FDU-1200 型冷冻干燥机，日本东京理化器械有公司；TAS-990AFG 型原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；MC1000 型离子溅射仪、S-3400N 型扫描电子显微镜，日本日立公司；SPD-16 型高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.4 试验方法

1.4.1 太白韭乙醇提取物制备 参考李璐等[1]的方法制备太白韭乙醇提取物。取太白韭样品粉末，以体积分数60%乙醇溶液为提取溶剂，先在50℃水浴中浸提2 h，之后超声波辅助提取20 min，重复提取3 次，滤液合并后减压蒸馏，冻干后得到太白韭乙醇提取物。

1.4.2 最小抑菌质量浓度（MIC）测定 采用二倍稀释法测定太白韭乙醇提物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度[7]。用无菌液体培养基作为阴性对照，用苯甲酸钠和氨苄青霉素钠作为阳性对照。试验重复3 次。

1.4.3 抑菌圈的测量 采用牛津杯法测量太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径[8]。用无菌生理盐水作为阴性对照，用苯甲酸钠和氨苄青霉素钠作为阳性对照，用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验重复3 次。

1.4.4 生长曲线绘制 参考Huang 等[9]的方法，用无菌液体培养基将太白韭乙醇提取物配制成终质量浓度为1/2MIC 和MIC 的溶液，加入2%的菌悬液，在37 ℃，110 r/min 条件下连续培养24 h，每隔1 h 取2 mL 培养液，测定1/2MIC 和MIC 太白韭乙醇提取物处理组培养液在600 nm 波长处的吸光值（试验组）。以不添加太白韭乙醇提取物的无菌液体培养基为对照组。以培养时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制生长曲线。试验重复3 次。

1.4.5 电导率的测定 参考Li 等[10]的方法，定时测定上述试验组、对照组的电导率，以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制电导率变化曲线。试验重复3 次。

1.4.6 钾、钙、钠、镁离子含量的测定 参考Wang等[11]的方法，使用原子吸收分光光度计测定钾、钙、钠、镁离子的含量。试验重复3 次。以离子浓度为横坐标（x）、吸光值为纵坐标（y）绘制标准曲线，K+，Ca2+，Na+，Mg2+的标准曲线方程分别为y=0.4999x + 0.0204（相关系数R2=0.9981），y=0.0344x + 0.0154（R2=0.9947），y=0.9493x +0.1632（R2=0.9757），y=0.56x + 0.0608（R2=0.9581）。

1.4.7 核酸、蛋白质与多糖含量的测定 参照李璐等[12]的方法测定胞外核酸含量。参考Gen 等[13]的方法，以牛血清蛋白溶液为标准溶液，采用考马斯亮蓝法测定胞外蛋白含量。以培养时间为横坐标（x）、蛋白质含量为纵坐标（y）绘制标准曲线，其回归方程为y=3.0327x+0.651（R2=0.9758）。参考Zhang 等[14]的方法，以葡萄糖溶液为标准溶液，采用苯酚硫酸法测定胞外多糖含量。以培养时间为横坐标（x）、多糖含量为纵坐标（y）绘制标准曲线，其回归方程为y=7.9949x+0.1071（R2=0.9980）。试验重复3 次。

1.4.8 细胞壁完整性分析 每隔6 h 取上述试验组、对照组处理液2 mL，4 000 r/min 离心10 min留上清液，用碱性磷酸酶检测试剂盒测定酶活力。以培养时间为横坐标、碱性磷酸酶活力为纵坐标绘制酶活力变化曲线。试验重复3 次。

1.4.9 内膜透化作用分析 参考Tao 等[15]的方法绘制内膜透化作用变化曲线。试验重复3 次。

1.4.10 电子显微镜分析 参考Li 等[16]的方法，取上述试验组、对照组处理液，4 000 r/min 离心10 min 收集沉淀，用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3 次，加入2.5%戊二醛溶液，于4 ℃固定12 h，离心收集菌体沉淀，用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3 次，再用体积分数30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇溶液依次洗涤菌体。待菌体自然风干后，使用离子溅射仪喷金，而后使用扫描电子显微镜观测细菌形态变化。

1.4.11 高效液相色谱分析 称取10 mg 太白韭乙醇提取物，溶于10 mL 甲醇中，用0.45 μm 滤膜过滤后即得太白韭乙醇提取物样品溶液。使用高效液相色谱仪分析太白韭样品溶液的化学组成。参照张民等[17]的方法测定大蒜素和蒜氨酸的含量。参照潘兴娇等[18]的方法测定尿苷、β-胸苷、腺苷和2’-脱氧腺苷的含量。参考王洋[19]的方法测定芦丁、山柰酚、槲皮素和异鼠李素的含量，色谱条件优化如下：色谱柱为Luna-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温25 ℃；流动相A 为甲醇，B 为水；梯度洗脱程序为0～3 min（50%～30%B），3～8 min（30%～26%B），8～10 min（26%～25%B），10～12 min（25%～22%B），12～15 min（22%～50%B）；紫外检测波长360 nm；进样量20 μL；流速1.0 mL/min。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 软件画图，采用最小显著差数t 检验方法分析差异显著性，P＜0.05（P ≥0.01） 和P＜0.01 分别表示平均数之间差异显著、极显著。

2 结果与分析

2.1 太白韭的抑菌活性

由图1可见，随着太白韭乙醇提取物质量浓度的增加，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径不断增大，说明太白韭的抑菌活性具有剂量依赖性。太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC 为15 mg/mL。

2.2 太白韭的抑菌机理

2.2.1 太白韭对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响由图2可以看出，未经太白韭乙醇提取物处理的金黄色葡萄球菌（对照组）生长正常，具有典型的迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期4 个微生物生长阶段。经1/2MIC 和MIC 太白韭乙醇提取物处理后，金黄色葡萄球菌没有明显的对数期，生长受到较大程度抑制。

2.2.2 太白韭对金黄色葡萄球菌电导率的影响由图3可见，金黄色葡萄球菌培养3 h 后，试验组菌体培养液的电导率明显升高。1/2MIC 和MIC 太白韭乙醇提取物处理的培养液电导率显著高于对照组（P＜0.05），MIC 处理组的电导率显著高于1/2MIC 处理组（P＜0.05）。这可能是因为太白韭乙醇提取物作用于菌体时，细胞膜遭到破坏，胞内电解质渗出，从而导致菌体培养液的电导率增加[20]。

图1 太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径Fig.1 Inhibitory zone diameter of ethanol extract from Allium prattii against Staphylococcus aureus

图2 金黄色葡萄球菌的生长曲线Fig.2 Growth curve of Staphylococcus aureus

图3 金黄色葡萄球菌的电导率Fig.3 Conductivity of Staphylococcus aureus

2.2.3 太白韭对金黄色葡萄球菌胞外离子含量的影响 由图4可以看出，MIC 太白韭乙醇提取物处理组的金黄色葡萄球菌胞外钾、钙、钠、镁离子含量显著高于1/2MIC 处理组（P＜0.05），并且1/2MIC 和MIC 处理组均显著高于对照组（P＜0.05），提示太白韭乙醇提取物可能使金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性发生改变，从而引起菌体细胞内的钾、钙、钠、镁离子外泄。胞外离子质量浓度升高可能是菌体培养液电导率改变的重要原因[21]。

图4 太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌钾、钙、钠和镁离子含量的影响Fig.4 Effects of ethanol extract from Allium prattii on contents of K+， Ca2+，Na+ and Mg2+ of Staphylococcus aureus

2.2.4 太白韭对金黄色葡萄球菌胞外核酸含量的影响 如图5所示，MIC 太白韭乙醇提取物处理组金黄色葡萄球菌胞外核酸含量显著高于1/2MIC 处理组，并且两者均显著高于对照组（P＜0.05），说明太白韭乙醇提取物可能破坏了细胞膜结构的完整性，导致核酸等生物大分子大量泄漏[22]。由此推断，太白韭乙醇提取物能够影响金黄色葡萄球菌的核酸代谢，最终抑制菌体生长繁殖。

2.2.5 太白韭对金黄色葡萄球菌胞外蛋白含量的影响 由图6可见，随着金黄色葡萄球菌培养时间的延长，太白韭乙醇提取物试验组细菌胞外蛋白质含量明显升高，而对照组细菌胞外蛋白质含量的变化较小。太白韭乙醇提取物处理12 h 后，MIC 处理组的胞外蛋白质含量显著高于1/2MIC处理组（P＜0.05）。这可能是由于太白韭乙醇提取物使得金黄色葡萄球菌的细胞膜受到严重破坏，从而导致胞内蛋白质外溢。

图5 太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌核酸含量的影响Fig.5 Effect of ethanol extract from Allium prattii on contents of nucleic acids of Staphylococcus aureus

2.2.6 太白韭对金黄色葡萄球菌胞外多糖含量的影响 由图7可以看出，随着金黄色葡萄球菌培养时间的延长，试验组培养基中的胞外多糖含量明显增加，而对照组胞外多糖含量变化很小。太白韭乙醇提取物作用8 h 后，MIC 处理组胞外多糖含量显著高于1/2MIC 处理组（P＜0.05），并且两者皆显著高于对照组（P＜0.05），说明太白韭乙醇提取物可能影响了金黄色葡萄球菌的多糖代谢过程。

图6 太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌蛋白质含量的影响Fig.6 Effect of ethanol extract from Allium prattii on contents of protein of Staphylococcus aureus

2.2.7 太白韭对金黄色葡萄球菌细胞壁完整性的影响 碱性磷酸酶通常存在于细菌细胞壁和细胞膜之间，在正常情况下，细胞外检测不到，然而在细胞壁遭到破坏时，碱性磷酸酶可能外泄[23]。由图7可以看出，经太白韭乙醇提取物处理过后，试验组细菌胞外碱性磷酸酶活力较对照组明显增大，且MIC 组显著高于1/2MIC 组（P＜0.05），说明太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的细胞壁有一定的破坏作用，从而导致胞外碱性磷酸酶活力增加。太白韭乙醇提取物的质量浓度越高，对菌体细胞壁的破坏作用越强。

2.2.8 太白韭对金黄色葡萄球菌内膜通透性的影响 β-半乳糖苷酶是一种细菌内源性酶，在正常情况下其活性变化很小，然而当细胞内膜遭到破坏时其可能逸出细胞。β-半乳糖苷酶可将ONPG水解成邻硝基苯酚（ONP），检测ONP 的吸光度可以了解该酶的活力，进而判断细胞内膜通透性的变化[24]。从图9可以看出，随着培养时间的延长，试验组培养液的吸光度明显增加，而对照组变化很小。培养4 h 后，MIC 太白韭乙醇提取物处理组的吸光度显著高于1/2MIC 处理组（P＜0.05），并且两者均显著高于对照组（P＜0.05）。据此推断，太白韭乙醇提取物可能严重破坏了细菌细胞内膜的通透性，从而导致大量β-半乳糖苷酶从细胞在释放出来。胞外核酸、蛋白质、多糖等定量分析试验也提示太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌细胞膜具有较强的破坏效应。

图7 太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌多糖含量的影响Fig.7 Effect of ethanol extract from Allium prattii on contents of polysaccharides of Staphylococcus aureus

图8 太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌碱性磷酸酶活力的影响Fig.8 Effects of ethanol extracts from Allium prattii on the activity of alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

图9 金黄色葡萄球菌β-半乳糖苷酶活性Fig.9 Activity of β-galactosidase of Staphylococcus aureus

2.2.9 太白韭对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响由图10可见，正常的金黄色葡萄球菌菌体细胞完整，呈近圆球形，表面平整、光滑，细胞之间有明确的分界线（图10a）。与正常对照组相比，试验组细菌菌体发生了明显变化。其中，1/2MIC 太白韭乙醇提取物处理后，少量细菌细胞变形，细胞之间出现严重的粘连现象（图10b）；MIC 太白韭乙醇提取物处理后，绝大多数细胞严重变形，呈椭球形，细胞表面出现皱缩或裂口，部分菌体之间通过胶状物质相互粘连、聚合（图10c）。可以看出，太白韭乙醇提取物能够明显破坏金黄色葡萄球菌的细胞形态，并且提取物质量浓度越高，对菌体的破坏程度越严重。

图10 金黄色葡萄球菌形态观察Fig.10 Morphology of Staphylococcus aureus

2.3 太白韭乙醇提取物的化学组成

采用高效液相色谱法检测了太白韭乙醇提取物中的化学成分（图11和表1）。太白韭乙醇提取物中含有大蒜素和蒜氨酸2 种含硫类化合物，尿苷、β-胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷4 种含氮类化合物，以及芦丁、山柰酚、槲皮素和异鼠李素4 种黄酮类化合物（图11）。其中黄酮类化合物和含硫类化合物含量较高，含氮类化合物含量较低（表1）。大蒜素是重要的含硫化合物，能有效抑制大肠杆菌、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌、黑曲霉（Aspergillus niger）等的生长[25]；芦丁可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）、绿脓杆菌、酿脓链球菌等的生长[26]；山柰酚能够抑制金黄色葡萄球菌的生长[27]；槲皮素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、绿脓杆菌等具有一定的抑菌活性[28]。太白韭乙醇提取物中芦丁（22.277 mg/g）、槲皮素（21.258 mg/g）、大蒜素（16.619 mg/g）、山柰酚（6.177 mg/g）含量较高，这可能是其对金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的物质基础。

图11 太白韭乙醇提取物高效液相色谱分析Fig.11 High-performance liquid chromatograms of ethanol extract of Allium prattii

表1 太白韭乙醇提取物中化学成分的含量Table 1 Contents of phytochemicals in ethanol extract of Allium prattii

3 结论

太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，其最小抑菌质量浓度为15 mg/mL。太白韭乙醇提取物能够破坏金黄色葡萄球菌的细胞形态，对细胞壁完整性和细胞膜通透性产生明显影响，引起胞外金属离子（K+，Ca2+，Na+，Mg2+）、生物大分子（蛋白质、核酸、多糖）含量以及菌体培养液电导率升高，导致菌体之间相互粘连、聚合。太白韭乙醇提取物中共检测出10 种化学成分，包括大蒜素和蒜氨酸2 种含硫类化合物，尿苷、β-胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷4 种含氮类化合物，以及芦丁、山柰酚、槲皮素和异鼠李素4 种黄酮类化合物。太白韭乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性可能与其中所含的芦丁、槲皮素、大蒜素、山柰酚等化合物有关。本研究为太白韭资源的利用以及金黄色葡萄球菌抑菌剂的开发提供了依据。