章鱼墨囊黑色素的提取及理化性质研究

李 娇，王向红，周 畅，李希羽，智童心，桑亚新

（河北农业大学食品科技学院 河北保定071000）

章鱼（Octopodidae）又称蛸类，望潮等[1]，是一种重要的海洋水产品资源。然而，章鱼加工过程产生了50%以上的副产物，往往未加利用就被丢弃，造成了极大的浪费和环境污染[2]。其中，章鱼肝脏是副产物中体积分数最大的，章鱼墨囊内嵌于肝脏，含有黑色素等生物活性物质，而目前对于章鱼墨黑色素的研究鲜有报道。

黑色素是目前分布最广的一类天然色素，存在于微生物及动、植物体内。天然黑色素的理化性质几乎是相同的，与分类和结构无关[3]，其中，最具特征的是溶解性、光吸收性、氧化还原性、金属螯合特性等。黑色素一般呈黑色、棕黑色或棕色[4]且一般不溶于水，在碱性溶液中溶解，在酸性溶液中沉淀[5]。从乌骨鸡[6]、黑芝麻[7]、黑木耳[8]及短梗霉[9]中提取的黑色素具有相似的溶解性。章鱼墨黑色素属于真黑色素，主要结构为吲哚-5，6-醌（DHI），2-羧基-吲哚-5，6-醌（DHICA）[10]。天然真黑素具有高度的聚合性，其性质随溶液pH 值、金属离子，糖及蛋白质等发生改变[11]。黑色素具有重要的生物功能。雷敏等[12]用高速离心法提取制备鱿鱼墨黑色素，结果证明其对小鼠机体的免疫反应产生重大影响。徐幸莲等[13]研究发现乌骨鸡黑色素具有类似SOD 的效果。郭欣等[14]利用超声降解法制备的鱿鱼墨黑色素具有较强的抗氧化能力。Elobeid 等[15]发现黑色素可调节细胞因子起到抗肿瘤作用。

目前天然黑色素的分离纯化方法主要有水洗法、碱溶酸沉法、酶解法和层析法。水洗法适合于杂质较少的样品制备。陈士国[11]采用水洗高速离心法提取得到鱿鱼墨黑色素，结构保存良好。碱溶酸沉法则利用黑色素碱溶酸沉的性质，然而研究表明该处理使黑色素的结构发生变化[16]。吴晨霞等[17]采用碱提酸沉的方法提取木耳黑色素，结果表明在提取时间60 min，温度30 ℃，氢氧化钠浓度1.50 mol/L，料液比1∶50 的条件下黑色素提取率为7.19%。李维莉等[18]采用碱提酸沉的工艺分离纯化黑葵花籽皮色素，其得率为12.5%。酶解法反应温和，结构保存完整，而工艺复杂，且蛋白酶较为昂贵。王立等[19]在提取乌饭树树叶黑色素过程中添加果胶酶和纤维素酶，提高了黑色素的提取率。余清等[20]采用传统工艺和复合酶相结合的方法，提高了黑色素的提取率。王霞等[21]采用硅胶层析柱对黑甜玉米黑色素进行纯化及一系列工艺，所得红色晶体即为纯化的黑色素。

本研究以章鱼加工副产物墨囊作为原料，对比高速离心法和酶解法2 种章鱼墨黑色素的提取方法，研究章鱼墨黑色素的理化性质，以期为章鱼墨囊黑色素的综合利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

章鱼肝脏，唐山丰瑞水产食品有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2800H 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-2 型恒温水浴锅，常州市易晨仪器有限公司；TGL-16M 台式高速冷冻离心机，长沙易达仪器公司；FD5-2.5 真空冷冻干燥机，美国SIM International Group；恒温磁力搅拌器，美国SIM 仪器有限公司；DZF-6030B 真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 章鱼墨黑色素的提取

1.3.1 高速离心法 剥开新鲜章鱼肝脏，取下墨囊，蒸馏水冲洗去除表面杂质，剪开囊膜，挤出墨汁，用0～4 ℃等体积水浸泡过夜。10 000 r/min 离心20 min，反复加水润洗沉淀部分，重复4～6 次，直至上清液中无明显杂质。收集沉淀，冻干后即得高速离心法提取的章鱼墨黑色素样品。

1.3.2 酶解法 前处理方法同1.3.1 节所述，将溶液于10 000 r/min 离心20 min，调节pH 值为8，添加地衣芽胞杆菌蛋白酶（200 U/mg），50 ℃下酶解6 h，90 ℃水浴加热10 min，经反复润洗，离心至中性，收集沉淀，冻干即得酶解法提取的黑色素样品。

1.4 章鱼墨黑色素的紫外光谱扫描

分别将上述2 种方法制备的章鱼墨黑色素2 mg，溶于25 mL 1%NaOH 溶液中，水浴加热10 min，制得稳定溶液，于200～800 nm 波长下扫描。

1.5 章鱼墨黑色素的SEM 图谱及粒径分析

将2 种方法提取得到的章鱼墨黑色素粘在导电胶带上，表面喷金粉后使用扫描电镜进行分析，所得SEM 图谱采用Nano Measurer 1.2 分析软件进行像素二值化，对其直径进行分析，所得数据均导出到Origin 软件，作粒径分布图。

1.6 章鱼墨黑色素理化性质的测定

1.6.1 溶解性 将2 mg 章鱼墨黑色素与各种有机溶剂、常见无机溶剂、混合缓冲盐等涡旋1 min左右混匀，室温放置30 min 后，观察其颜色及溶解度的变化。

1.6.2 酸碱稳定性 根据高速离心法提取的章鱼墨黑色素在紫外区的特征吸收峰，计算其在pH 1～14 条件下的吸光度值，与处理前相比较，得出章鱼墨黑色素的色残率。计算方法见式（1）。

1.6.3 光照稳定性 分别称取8 份25.0 g 的墨黑色素样品溶于1%NaOH 溶液，涡旋后将其中一组样品置于自然光下照射30，60，90，120 min，另一组样品在紫外灯垂直照射30 cm 的位置，同样分别照射30，60，90，120 min，以未经过光线照射的样品为对照，分别测定波长230 nm 下的吸光值，计算照射前、后色残率的变化，计算方法见式（1）。

1.6.4 热稳定性 将16 份25.0 g 的章鱼墨黑色素样品分别在65，85，100 ℃和120 ℃条件下保温30，60，90，120 min，快速冷却至25 ℃左右，用等体积的1%NaOH 溶液将其分别溶解，依次测定每个样品溶液在波长230 nm 处的色残率，计算方法见式（1）。

2 结果与分析

2.1 章鱼墨黑色素的光谱分析

2.1.1 章鱼墨黑色素的紫外-可见吸收光谱分析

2 种提取方法得到的章鱼墨黑色素的紫外-可见吸收光谱如图1、图2所示。由图1可知，高速离心法提取得到的章鱼墨黑色素主要在紫外光区域（190～400 nm）的波长230 nm 处存在一个明显吸收峰，在波长326 nm 处存在一个较明显的吸收峰，而在可见光区域并没有明显的吸收峰。由图2可知，酶法提取的黑色素在紫外光区域（190～400 nm）的波长210 nm 处存在一个明显吸收峰，在波长270 nm 处存在一个弱吸收峰，可能由蛋白质中的芳族氨基酸残基引起。郭欣等[14]采用超声降解法制备可溶性鱿鱼墨黑色素，发现其拥有不同的清除自由基活性。宋茹等[22]研究不同精制方法对鱿鱼墨黑色素的影响，发现在波长220 nm 处有较强紫外吸收峰，胃蛋白酶水解和酸水解法使黑色素的氨基基团被脱离，扫描电镜结果显示酸水解法会破坏黑色素结构。

图1 高速离心法提取的章鱼墨黑色素紫外-可见光谱图Fig.1 UV-VIS spectra of melanin from octopus extracted by high speed centrifugation

2.1.2 章鱼墨黑色素的SEM 图谱分析 图3为2种提取方法得到的扫描电镜图谱，其中a 和c 分别为酶解法提取得到的章鱼墨黑色素在20k 和50k 倍下的SEM 图谱，b 和d 分别为高速离心法提取得到的章鱼墨黑色素在20k 和50k 倍下的SEM 图谱。由图3可知，章鱼墨黑色素均由边缘清晰的球状颗粒组成，酶法提取的黑色素产生了凹沟和凹洞，而高速离心法提取的黑色素大小相对集中，颗粒紧和程度更加明显，这可能是因为黑色素颗粒上有蛋白质，这种蛋白与黑色素紧密连接在一起，基本可以认定为黑色素的存在形式，酶法可能破坏了黑色素的结构，导致其与蛋白质分离，从而使黑色素不完整。

图2 酶法提取的章鱼墨黑色素紫外-可见光谱图Fig.2 UV-VIS spectra of melanin from octopus extracted by enzymic method

图3 不同提取方法得到的章鱼墨黑色素SEM 图Fig.3 SEM spectra of melanin from octopus by different extracting methods

图4 酶法提取的章鱼墨黑色素颗粒的直径分布Fig.4 Diameter distribution of melanin from octopus extracted by enzymic method

图5 高速离心法提取的章鱼墨黑色素颗粒的直径分布Fig.5 Diameter distribution of melanin from octopus extracted by high speed centrifugation

如图4和图5所示，数据显示约由250～300个黑色素颗粒小球堆积而成，酶解法制得章鱼墨黑色素微球的平均粒径为133 nm，大部分都在50～200 nm 之间，高速离心法制得黑色素平均粒径为123 nm，不仅含有颗粒直径在50～200 nm 之间的小球，还增加了许多直径小于50 nm 的微球，而结构保存完好。

综合SEM 图谱及粒径分布，结合生产成本及生产效率，本研究选择采用高速离心法提取章鱼墨黑色素。李和生等[23]使用碱性蛋白酶提取乌贼墨黑色素，其扫描电镜图谱发现乌贼黑色素由许多单体小球聚合而成，呈圆滑状，平均粒径约118 nm。

2.2 章鱼墨黑色素的理化性质分析

2.2.1 高速离心法制得的章鱼墨黑色素溶解性分析 由表1可知，对于大部分有机试剂，章鱼墨黑色素并不相溶，呈现出沉淀或者悬浮的状态，在偏碱性的缓冲液中，常温下可部分溶解，50 ℃加热条件下可全部溶解，溶液状态不稳定，溶液大体上呈棕黑色，或有絮状沉淀；在NaOH 溶液中章鱼墨黑色素全部溶解，溶液呈棕褐色。上述结果可知章鱼墨黑色素具有碱溶酸沉的特性。

2.2.2 章鱼墨黑色素对酸碱稳定性的分析 表2和图6分别为章鱼墨黑色素在不同pH 值下的色残率及紫外-可见光谱图。以未经过光线照射的样品为对照。一般来说，黑色素不溶于酸性溶液，且酸法对黑色素颗粒损伤较大，章鱼墨黑色素在不同pH 值条件下呈现出一定的规律性：色残率随溶液碱性增强而增大，即稳定性逐渐升高。由表2可知，在弱酸性条件下，章鱼墨黑色素的吸光度及色残率随pH 值的降低而降低；当pH 值为中性时，色残率仅为对照的一半左右，表明过低的pH值不利于章鱼墨黑色素的稳定，在pH 值大于9.0的碱性溶液中，吸光度及色残率随碱性增强而增大，溶液较稳定。由图6所示，在pH 1～14 时，随着溶液酸性逐渐增强，其吸光度逐渐降低，并且在230，326 nm 波长处有明显的吸收峰。结果表明，章鱼墨黑色素在酸性溶液中不稳定，在碱性溶液中随着pH 值的增加，吸光值逐渐增加，即稳定性逐渐增强。

表1 章鱼墨黑色素在不同溶剂中的溶解性Table 1 Solubility of melanin from octopus in different solvents

2.2.3 章鱼墨黑色素对光照稳定性的分析 章鱼墨黑色素对光照的稳定性如图7所示，高速离心法制备的章鱼墨黑色素经过自然光照射30 min时，色残率为对照组的95.6%，而经过紫外光线照射30 min 后，其色残率为对照组的66.7%。此后随着光照时间的延长，在相同的光照时间内，章鱼墨黑色素经过自然光照射后的色残率显著高于紫外光照射的结果，表明高速离心法制备的章鱼墨黑色素耐受自然光照射，而其在紫外光照射下的稳定性较差。

表2 章鱼墨黑色素在不同pH 值下的色残率Table 2 Color residual rate of melanin from octopus in different pH values

2.2.4 章鱼墨黑色素对热稳定性的分析 如图8所示，在保温30 min 的条件下，章鱼墨黑色素在65，85，100，120 ℃条件下的色残率都在80%以上。在65 ℃时，色残率最高能够达到95.4%，且在此温度下，随着加热时间的延长，色残率下降趋势非常缓慢，直到120 min 时，黑色素的色残率仍高达91.3%。当温度达到85 ℃时，在0～60 min 内，色残率下降缓慢，加热60 min 后，色残率下降呈线性趋势。当加热温度达到100 ℃和120 ℃时，随着黑色素加热时间的延长，其色残率快速降低，加热120 min 时，该黑色素的色残率分别下降至39.5%，32.1%。由此可知，高速离心法制备的章鱼墨黑色素对高温长时间加热处理不耐受。

图6 章鱼墨黑色素在不同pH 值下的色残率Fig.6 UV-VIS spectra of melanin from octopus in different pH values

3 结论

图7 章鱼墨黑色素的光照稳定性Fig.7 Optical stability of melanin from octopus

图8 章鱼墨黑色素的热稳定性Fig.8 Thermal stability of melanin from octopus

本试验以章鱼加工副产物为原料，比较了高速离心法和酶解法2 种章鱼墨黑色素的提取方法，同时研究了其理化性质。研究结果表明，酶法可能破坏了黑色素的结构，导致与蛋白质的分离，从而使黑色素不完整，而高速离心法提取的章鱼墨黑色素在紫外光区域的230 nm 和326 nm 波长处分别存在一个明显和较明显的光谱吸收峰，其结构保存较完整。章鱼墨黑色素的理化性质分析表明其不溶于大部分有机、无机试剂，具有碱溶酸沉特性；该黑色素对自然光照条件耐受性较好，对紫外光不耐受。在长时间高温加热条件下的稳定性较差，并且随着溶液碱性的增强其稳定性升高。本研究对章鱼副产物的深加工提供了一定的理论基础。