茶薪菇酚类提取物的抗氧化功效评价

吴 俐，翁敏劼，李怡彬，汤葆莎，赖谱富，郑恒光，沈恒胜

（福建省农业科学院农业工程技术研究所 福州350003）

茶薪菇（Agrocybechaxingu Huang）是一种药食两用的食用菌珍稀品种，最早发现野生茶薪菇仅生长于油茶树上[1]。田头菇属食用菌含有催化底物过氧化氢羟基转移并形成酚类化合物的胞外过氧化物酶（Agrocybeaegerita peroxidase，AaP）[2-4]。本课题组前期研究发现，茶薪菇子实体的酚类提取物以黄酮醇类为主，其子实体的酚类物质含量约为金福菇的1.67 倍；化学法测定其酚类提取物的抗氧化能力较强；茶薪菇液体代谢产物的抑制脂质氧化能力较强[5]。然而，国内外大量研究都基于对茶薪菇多糖的降血糖[6]，免疫调节[7]，抗氧化[8]，抗血管生成[9]，抗炎[10]和抑制破骨细胞形成[11]等生物活性方面，少见茶薪菇不同溶剂提取物的酚类含量及其抗氧化特征和能力的研究。本试验采用不同溶剂分别提取茶薪菇，通过茶薪菇不同提取物的总酚、总糖及其体外抗氧化特征，分析茶薪菇的抗氧化组分对正常小鼠的抗氧化能力以及D-半乳糖衰老小鼠抗衰老能力的影响，为进一步开发茶薪菇抗氧化多酚提供试验基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

正常小鼠抗氧化活性实验动物：福建医科大学实验动物中心提供的雄性清洁级ICR 小鼠40只，体重（20±2）g，动物证号SCXK（闽）2012-0001。D-半乳糖氧化损伤小鼠模型实验动物：福建医科大学实验动物中心提供雄性清洁级ICR 小鼠50只，体重（20±2）g，动物证号SCXK（闽）2012-0001。饲料：福建医科大学实验动物中心提供。

茶薪菇子实体（干品），福建益升食品有限公司。

D-半乳糖、藏红花T、铁氰化钾、氯化铁、焦性没食子酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、丙酮、乙醇等试剂均为分析纯级；丙二醛、超氧化物歧化酶试剂盒，南京建成生物工程技术研究所。

1.2 仪器与设备

BL60S 电子天平，德国Sartrius 公司；高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-6 电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；KQ-600DV 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；765P型紫外-可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；SCIENTZ-30ND 冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶薪菇不同溶剂组分的制备

1） 茶薪菇水提物 茶薪菇子实体干粉，按照1∶20 的料液比，添加蒸馏水浸提，80 ℃提取1 h，提取3 次。合并滤液。

2） 茶薪菇丙酮提取物（水解单宁）[12-13]茶薪菇子实体粉末，按照1∶20 的料液比，添加1%HCL的7∶3 丙酮水溶液浸提，30 r/min 室温提取1 h，提取3 次。合并滤液。

3） 茶薪菇乙醇提取物（缩合单宁）[14-15]茶薪菇子实体粉末，按照1∶20 的料液比，添加弱酸性6∶4（体积比）的乙醇水溶液（pH 6），在室温下用超声波提取，功率300 W，频率100 kHz，浸提0.5 h，提取3 次。合并滤液。28～30 ℃，50～60 r/min，在

旋转蒸发仪中浓缩至1/3 体积，冻冻干燥。

1.3.2 茶薪菇水提物、丙酮提取物、乙醇提取物的总酚、总糖和抗氧化活性测定

1） 总酚 普鲁士蓝法[5]；

2） 总糖 苯酚硫酸法[5]；

3） 茶薪菇酚类物分离组分的抑制脂质过氧化作用 卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸（PUFA）过氧体系法[16]；

4） 茶薪菇酚类物分离组分清除羟自由基作用 Fenton 体系法[17]；

5） 茶薪菇酚类物分离组分清除超氧阴离子作用 邻苯三酚体系法[18]。

1.3.3 茶薪菇提取物对正常小鼠抗氧化活性测定筛选在体外抗氧化活性测定中，表现出抗氧化能力最强的茶薪菇提取物，灌胃给予正常小鼠，并测定其血清抗氧化指标，为后续D-半乳糖衰老动物的体内抗氧化功效评价提供灌胃水平和抗氧化能力等实验依据。以生理盐水组、50 mg/（kg bw·d）阿魏酸组和维生素E（VE）组为对照，经口连续灌胃12 mg/（kg bw·d）茶薪菇水提物（以总酚含量计）10 d，每组10 只小鼠，每只小鼠灌胃量为0.2 mL/10g。定期称量动物体重，并按体重调整灌胃量；最后1 d 灌胃1 h 后，小鼠眼内眦静脉取血，分离血清测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量；其后脱颈椎处死动物，称量肝、脾、胸腺组织。

1.3.4 D-半乳糖小鼠衰老模型评价茶薪菇酚类物的抗氧化功效 以茶薪菇水提物对正常小鼠的抗氧化功效评价实验结果为依据，采用D-半乳糖衰老动物模型评价茶薪菇提取物对衰老小鼠的体内抗氧化功效。

1） 造模方法及模型验证 采用D-半乳糖致亚急性衰老法[19]，通过连续腹腔注射D-半乳糖，使得机体细胞内过量累积的D-半乳糖在醛糖还原酶作用下生成无法被细胞代谢的半乳糖醇，影响细胞的渗透压，使细胞肿胀，进而发生细胞功能障碍、代谢紊乱，最终导致机体衰老。体重（18±4）g的ICR 雄性清洁小鼠50 只，除空白对照组（10只） 外，其余40 只小鼠用D-半乳糖400 mg/（kg bw·d）腹腔注射造模，注射量为0.1 mL/10 g，每日1 次，空白对照组注射等体积生理盐水，连续造模8 周，每周定期称重1 次，依据每周体重调整给药剂量。分别在造模第6 周和第8 周，用内径1.0～1.5 mm 的玻璃毛细管从眼眶静脉丛采血0.5 mL/只，室温静置1 h 后，4 ℃，3 000 r/min 离心10 min，分离血清测定丙二醛含量，验证小鼠造模是否成功。第8 周造模组小鼠MDA 含量与对照组相比具有统计学意义，提示造模成功。

2） 分组与给药 ICR 小鼠适应期3 d，根据体重随机分为空白对照组10 只，造模组40 只。D-半乳糖模型成功后，将40 只造模小鼠依据第8周小鼠血清的MDA 含量随机分为模型对照组和茶薪菇水提物高、中、低剂量组。从第9 周开始，继续腹腔注射D-半乳糖的同时，处理组灌胃10，20，40 mg/（kg bw·d）的茶薪菇水提物（以总酚含量计，以1.3.3 节的实验结果为依据），灌胃量为0.2 mL/10 g，空白对照组和模型对照组用相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液替代，灌胃期45 d。每周定时称重，根据每周体重平均值调整灌胃量。实验结束眼眶后静脉丛采血。饲养管理：每笼4 只小鼠，室温（22±2）℃，湿度60%～65%，自由饮食，隔日更换垫料[20]。

3） 检测 最后一次灌胃0.5 h 后，小鼠眼内眦静脉取血分离血清，检测血清丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和蛋白质羰基含量，检测方法参照南京建成生物工程技术研究所试剂盒的说明书。

1.4 数据统计

实验数据采用SPSS13.0 进行统计分析，单因素ANQVA 检验比较显著性。

2 结果与分析

2.1 茶薪菇水提物、丙酮提取物、乙醇提取物的制备结果

以茶薪菇酚类物质的极性差异为分离依据，分别采用去离子水、丙酮水溶液和乙醇水溶液分离获得以水解单宁为主要成分的丙酮提取物，以及以缩合单宁为主要成分的乙醇提取物；采用不同溶剂分离得到茶薪菇水提物约占子实体总质量的31.62%，茶薪菇丙酮提取物含量约为36.67%；茶薪菇乙醇提取物的含量约为38.17%。

2.2 定性、定量分析茶薪菇不同提取物总酚、总糖及抗氧化活性

茶薪菇水提物、丙酮提取物和乙醇提取物的总酚含量分别为1.25‰，1.01‰，1.68‰，说明用乙醇水溶剂体系提取茶薪菇子实体可以获得酚类的物质最多。一定浓度的酚类物质分离组分均具有一定的抗氧化能力。当茶薪菇水提物质量浓度为60.00 mg/mL，丙酮提取物质量浓度为146.47 mg/mL，乙醇提取物质量浓度为122.44 mg/mL 时，它们对Fenton 羟自由基的清除率在3 种体外抗氧化体系中最高，分别为87.00%，82.54%，79.73%；对邻苯三酚体系超氧阴离子清除率为19.88%，41.52%，57.06%；对卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸（PUFA） 过氧化的抑制率为65.31%，54.47%，57.85%。3 种不同溶剂提取物中体外抗氧化能力最强的是茶薪菇水提物。

表1 茶薪菇总酚、总糖含量及其体外抗氧化结果Table 1 The content of total phenol，total sugar of A.chaxingu and its antioxidant in vitro

2.3 茶薪菇水提物对正常小鼠抗氧化活性的影响

2.3.1 茶薪菇水提物对小鼠体重增重的影响 从图1可知，灌胃茶薪菇水提物组小鼠体重不断增加，灌胃前和灌胃第1 天相比较，小鼠体重增加较大，且在整个实验周期，茶薪菇水提物组小鼠体重变化与生理盐水对照组小鼠的体重变化基本相同，增重效果介于维生素E 对照组和阿魏酸对照组之间，说明灌胃茶薪菇水提物中酚类物质含量适宜，对消化道无明显不良刺激，不影响小鼠体重正常增长。

图1 茶薪菇水提物对小鼠体重增重的影响Fig.1 The effect of A.chaxingu aqueous extract on weight gain in mice

表2 小鼠脏器指数Table 2 Viscera index in mice

2.3.2 茶薪菇水提物对小鼠脏器指数的影响 从表2可知，生理盐水组、维生素E 组和阿魏酸组的胸腺指数均高于茶薪菇水提物组；与3 个对照组相比茶薪菇水提物组肝脏指数最高；茶薪菇水提物组的脾脏指数仅略低于维生素E 组，高于生理盐水组和阿魏酸组。因此，灌胃茶薪菇水提物的抗氧化能力，在一定程度上可以保护机体免疫器官脾脏，减缓因自由基损害导致的免疫器官萎缩。

2.3.3 茶薪菇水提物体内抗氧化能力 前期定性、定量分析酚类物质分离组分及体外抗氧化活性实验结果，茶薪菇酚类组分抗氧化特性显示，其茶薪菇水提取物的体外抗氧化能力最强，总酚含量介于丙酮提取物和乙醇提取物之间。从表3小鼠血清的SOD、MDA 值可见，茶薪菇水提物组SOD 值最高达130.43 U/mL；MDA 值显著低于生理盐水对照组（P＜0.05），抗氧化能力与维生素E和阿魏酸含量相当。茶薪菇水提物通过提高小鼠血清中超氧化物歧化酶活性，发挥清除体内过多活性氧自由基的作用，当机体的SOD 酶活降低，脂质过氧化物MDA 积累，导致细胞膜破坏，组织损伤等。因此，SOD 酶活和MDA 含量呈负相关，SOD 酶活越高，MDA 含量越低，反之亦成立。茶薪菇水提物的抗氧化机理可能是通过提高机体SOD酶活，清除体内过多的活性氧自由基，减少脂质自由基和过氧化物MDA 的积累，降低其对细胞膜破坏和组织损伤的作用，从而发挥抗氧化作用。

2.4 D-半乳糖小鼠衰老模型评价茶薪菇酚类物的抗氧化功效

根据《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》 附件1 抗氧化功能评价方法对抗氧化功效评价[21]的要求，实施D-半乳糖动物衰老模型功效评价与生理生化测试分析，为天然抗氧化剂研发提供科学依据。

2.4.1 茶薪菇水提物对衰老小鼠体重的影响 茶薪菇水提物处理前和灌胃45 d 后，所有组别的小鼠体重均无显著性差异（P＞0.05）。原因是在灌胃实验开始前的雄性ICR 小鼠大约14 周龄，小鼠已经成熟，生长发育趋于缓慢，体重增幅相对稳定。实验结果表明，茶薪菇水提物对小鼠的体重未产生明显的不良作用。

表3 茶薪菇水提物对正常小鼠血清抗氧化指标的影响Table 3 The effect of A.chaxingu aqueous extract on serum antioxidant index of the normal mice

表4 茶薪菇水提物对衰老小鼠体重的影响Table 4 The effect of A.chaxingu aqueous extract on body weight of aging mice

2.4.2 茶薪菇水提物对衰老小鼠血清抗氧化指标的影响 与空白对照组相比，D-半乳糖模型组小鼠的MDA 含量明显高于空白对照组（P＜0.01）。与模型组比较，茶薪菇水提物低、中、高剂量组MDA含量降低且差异极显著（P＜0.01）；茶薪菇水提物低剂量组GSH-Px 活力极显著提高（P＜0.01）。综合分析，茶薪菇水溶性酚类粗提物能明显拮抗D-半乳糖的作用，使得小鼠血清MDA 含量降低，GSH-Px 活性升高。其中，低剂量组提高GSH-Px活性的效果最好，MDA 含量降低至空白组正常小鼠水平。

表5 茶薪菇水提物对衰老小鼠血清的抗氧化指标的影响Table 5 The effect of A.chaxingu aqueous extract on serum antioxidant index of aging mice

3 讨论

3.1 茶薪菇多酚的体外抗氧化活性分析

前期研究比较了茶薪菇、金福菇、秀珍菇等几种不同食用菌子实体的酚类物含量及其抗氧化活性的关系，茶薪菇酚类化合物的浓度最高，酚类化合物成分以黄酮醇类化合物为主，且食用菌子实体的酚类物含量与其抗氧化活性呈明显正相关[22]，茶薪菇液体培养代谢产物同样具有明显的体外抗氧化作用[5，23]。其它文献报道茶树菇粗多酚对·OH 自由基清除能力与茶多酚相当，对·O－2自由基清除能力以及总抗氧化能力比VC 强[24]。本文研究结果显示，茶薪菇水、乙醇、丙酮提取物均具有清除·OH 自由基和·O－2自由基的抗氧化能力，与前人研究报道相一致[5，22]，不同之处在于研究还发现茶薪菇子实体和菌丝体均具有较强的抑制脂质过氧化的能力，茶薪菇酚类物具有开发油脂抗氧化剂的潜力。

3.2 茶薪菇提取物的体内抗氧化活性分析

衰老的自由基学说[25]认为体内产生过多的氧自由基氧化细胞膜中不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化、交联、聚合成脂褐素（lipofuscin），过多的氧自由基还会破坏细胞膜，使蛋白质和酶变性，从而加速衰老。氧化物含量（如MDA）和抗氧化酶活性（如GSH-Px、SOD 酶） 是评价机体氧化水平的主要指标。课题组前期采用D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型成功评价了液体发酵富硒秀珍菇菌丝体的体内抗氧化功效[20]。采用野生型黑腹果蝇作为模式动物，1 mg/mL 茶树菇多酚对雌雄果蝇寿命的延长率高于0.25，4 mg/mL 剂量组，与对照组相比达极显著水平[24]。本文通过分析茶薪菇水提取物对正常小鼠血清抗氧化指标的影响，实验结果与他人研究报道相一致。不同之处在于，本文还研究茶薪菇水提取物对D-半乳糖诱导的衰老小鼠血清抗氧化指标的影响，发现茶薪菇水提取物具有明显的拮抗D-半乳糖的衰老作用，并推测其抗氧化机制可能是通过提高GSH-Px、SOD 酶等抗氧化酶体系的活力，同时降低MDA 脂质氧化物含量，从而发挥抗氧化作用。

4 结论

茶薪菇水提物、丙酮提取物和乙醇提取物中，茶薪菇水提取物的总酚含量为1.25‰，介于丙酮提取物和乙醇提取物之间，对羟自由基的清除率高达87.00%，对卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化的抑制率高达65.31%。12 mg/（kg bw·d）（以总酚含量计）的茶薪菇水提物不影响正常小鼠体重增长，具有调高肝脏和脾脏指数的趋势，以及提高SOD 酶活和明显降低MDA 含量的作用（P＜0.05）。10，20，40 mg/（kg bw·d）的茶薪菇水提物（以总酚含量计） 极显著降低了衰老小鼠的MDA 含量（P＜0.01），20 mg/（kg bw·d） 剂量组的MDA 含量下降率高达94.53%；10 mg/（kg bw·d）剂量组的GSH-Px 活力极显著提高22.98%（P＜0.01）。茶薪菇水提物中酚类物质是体外和体内抗氧化的主要功效成分，通过提高SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活力，降低MDA 含量，发挥维持机体抗氧化稳态和拮抗D-半乳糖诱导的衰老损伤的作用。茶薪菇水提物中多酚类抗氧化组分分离纯化，以及抗氧化机理有待进一步研究。