牛α-乳白蛋白-油酸复合物对肿瘤细胞能量代谢的影响

杨志轩，方 冰，任发政，冷小京

（中国农业大学营养与健康系 教育部-北京市共建功能乳品重点实验室 北京100083）

癌症是世界范围内主要的公共卫生问题[1-2]，全球91 个国家的首要死因之一[3]。近年来，虽然有关癌症的预防、治疗研究进展迅猛，但其发病率亦居高不下，据报道，2006—2016年，全球癌症的发病率增加了28%[4]，我国每年有1 万多人被诊断为新发癌症[5]。开发有效的、毒副作用小的抗肿瘤药物仍是国内外研究的热点[6-7]，针对肿瘤细胞的分子靶向药物得到广泛关注[8]。

靶向药物是指一类能够与致癌因子特异性结合，通过一系列的生化反应使肿瘤细胞特异性凋亡或坏死，而不伤害肿瘤周围正常组织细胞的药物[9]。目前的分子靶向药物的设计靶点主要包括：表皮生长因子受体家族、血管生成相关、细胞膜特异性抗原等[10]。然而，在临床上，这类药物进入体内后，很可能造成治疗靶点发生基因突变而产生耐药性，还会激活肿瘤分子的其它信号通路，从而使药物失效[10]，因此在临床上通常采用多种靶点药物联合治疗的手段[11]。由不同药物的相互作用而产生的副作用还待进一步研究[12]。有研究表明，肿瘤细胞具有能量代谢旺盛的特点，靶向抗肿瘤药物也常以此为靶点进行药物设计，从而从根本上抑制肿瘤细胞的“生命源泉”[13]，并且不会产生耐药性，因此肿瘤细胞的能量代谢，成为近年来的分子靶向药物研发的热点[14-15]。

细胞可以利用葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等底物进行氧化供能产生ATP[16-17]，目前针对能量代谢这一靶点开发出的药物，基本上都是通过切断这些能量底物的供给，起到抑制肿瘤细胞的能量代谢，如2-脱氧葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose，2-DG）能够阻止葡萄糖转换为6-磷酸葡萄糖[14]，紫草素（Shikonin）或者奥利司他（Orlistat）能够阻止磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸[14]。然而，这些药物仅能够切断某一条功能通路，在临床应用时，往往不能够真正实现细胞内ATP 总量的降低。需开发一种能够直接降低ATP 含量的抗肿瘤药物，才能够从根本上切断肿瘤细胞的能量供给。

人乳中发现的乳白蛋白-油酸抗肿瘤复合物（α-LA-OA），在细胞和动物水平均证明其有良好的抗肿瘤效果。近年来研究发现，α-LA-OA 能够影响肿瘤细胞能量代谢的相关蛋白和基因，但其能否对肿瘤细胞的能量代谢产生影响仍缺乏直接证据。α-LA-OA 可选择性杀死肿瘤细胞而不影响健康分化细胞的活性，不仅在人胶质母细胞瘤[18]和膀胱癌的小鼠模型[19]中得到验证，还在人皮肤乳头状瘤[20]和膀胱癌患者[21]身上得到证实。α-LAOA 的抗肿瘤机制研究早期多集中于其激活凋亡[22]、自噬[23]等程序性死亡通路上。近年来研究发现，其抗肿瘤机制可能是通过干扰肿瘤细胞能量代谢，最终引发细胞死亡。Storm 等[24]发现，增强糖酵解和氧化磷酸化水平的基因——c-Myc，能够促进α-LA-OA 对肿瘤细胞的致死作用，并且通过抑制己糖激酶和丙酮酸激酶同功酶M2，将糖酵解转移至磷酸戊糖途径。Fang 等[25]利用蛋白质组学技术发现，α-LA-OA 能够显著影响肿瘤细胞中参与能量代谢的相关蛋白的表达。然而，现有研究并未直接评估α-LA-OA 处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞糖酵解、线粒体有氧呼吸这2 个能量代谢主要途径的变化。鉴于此，本文利用能量代谢仪研究α-LA-OA 处理肝癌细胞对肝癌细胞糖酵解及线粒体有氧呼吸过程的影响，为探明α-LA-OA 的抗肿瘤机制以及肿瘤靶向药物的开发，提供基础数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要细胞及培养条件 人肝癌细胞（HepG2），中国科学院细胞库。HepG2 培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。待细胞长至单层时，用含0.25%EDTA 的胰酶37 ℃消化处理2 min，按照1∶2 的体积比进行传代培养。

1.1.2 主要试剂 牛α-乳白蛋白（α-LA，纯度≥85%）、油酸（Oleic acid，OA，C18∶1∶9，顺式结构，纯度≥99.0%），Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；葡萄糖（Glucose，1.0 mol/L）、L-谷氨酰胺（L-glutamine，200 mmol/L）、丙酮酸（Pyruvate，100 mmol/L），安捷伦科技（中国）有限公司；胎牛血清，美国Gibco 公司；其它化学试剂均为分析纯级。

1.2 仪器及设备

3111 二氧化碳培养箱，美国Thermo 公司；DK-98-II2KW 洁净工作台，天津泰斯特仪器公司；ZDX35BI 自动高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；Sigma 3K30 低温高速离心机，德国Satorious 公司；KS260 电热恒温水浴摇床，德国IKA公司；Infinite M200 Pro 全波长酶标仪，瑞士TECAN 公司；XFe24 Seahorse 细胞能量代谢分析仪，安捷伦科技贸易（上海）有限公司。

1.3 α-LA-OA 制剂的配制

根据Fang 等[26]改进的方法制备，将α-LA 溶于磷酸盐缓冲液中，加入OA 后，于45 ℃加热使二者结合。同时将不添加OA 的α-LA 溶液作为对照；将不含α-LA 的溶液作为对照缓冲液。

1.4 细胞培养和细胞活力测定

将生长在对数期的HepG2 细胞以1x104个细胞/孔的密度接种在96 孔板中，生长24 h。分3组，分别加入对照缓冲液、α-LA 和α-LA-OA，使培养基终浓度分别为10，20，60，80 μmol/L，每个处理设置4 个副孔。在37 ℃培养箱中孵育24 h后，每孔加入10 μL 细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8，CCK-8） 溶液，37 ℃孵育1 h 后在波长450 nm 下读取每个孔的OD 值。细胞活力按式（1）计算。

1.5 糖酵解能力测定

细胞的操作如图1所示，将生长在对数期的HepG2 细胞以2×104个细胞/孔的密度接种在Seahorse XF24 专用细胞板中，其中设置4 个空白校正孔，将探针板用水化液在37 ℃活化12～72 h。专用细胞板在37 ℃，5%CO2下培养24 h 后，对细胞做3 种处理：分别加入对照缓冲液、α-LA、α-LA-OA，使终浓度均为0.4 μmol/L，每组设置6～7个副孔。24 h 后用只含有4 mmol/L L-谷氨酰胺的XF24 海马培养基替换原培养基，在无CO2、37 ℃条件下饥饿1 h，同时在XF24 探针板中的A，B，C孔中依次添加56 μL 葡萄糖溶液（10 mmol/L），62 μL 的寡霉素溶液（Olipomycin，1 μmol/L）和69 μL 2-脱氧葡萄糖溶液（50 mmol/L）。在Seahorse 能量代谢仪上测量HepG2 细胞中的胞外酸化率（ECAR），用以表征细胞的糖酵解能力。测定结束后，对每孔细胞进行消化、计数，用于均一化。

图1 细胞能量代谢仪的操作流程示意图Fig.1 Schematic diagram of the operation flow of the cell energy metabolism instrument

1.6 线粒体耗氧率（OCR）的测定

在能量代谢仪上测量HepG2 细胞中的线粒体耗氧率，用含有25 mmol/L 葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1 mmol/L 丙酮酸的XF24 海马培养基替换原培养基，在XF24 探针板的A，B，C 孔中依次添加56 μL 寡霉素（1 μmol/L），62 μL 的三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（1 μmol/L），69 μL 鱼藤酮（0.5 μmol/L）及抗霉素A（0.5 μmol/L）混合溶液。其它操作步骤同1.5 节。

1.7 统计分析

数值表示为至少3 次独立试验的平均值±标准差。数据用SPSS 统计软件（版本18.0）进行分析，使用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Duncan’s 检验，其中P＜0.05 视为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 α-LA-OA 的抗肿瘤活性

不同浓度的α-LA-OA 和α-LA 处理HepG2细胞24 h 后，细胞活力如图2所示。从图中可以看出，α-LA-OA 能够剂量依赖性的杀死肿瘤细胞，其剂量-效应关系曲线为y=-0.0111x+1.0924，R2=0.9776。而经过同样处理的α-LA 在所有测试剂量下，对肿瘤细胞的活性并无显著影响（P＜0.05）。

2.2 α-LA-OA 对糖酵解的影响

用40 μmol/L 的α-LA-OA、α-LA 和对照组处理HepG2 细胞24 h 后，细胞的胞外酸化率如图3所示。糖酵解的终产物为乳酸及二氧化碳（CO2），二者含量可以通过测定细胞中的酸化水平来评估，因此，糖酵解过程的变化可以通过胞外酸化率的变化反映。不同药物处理后的细胞，经过1 h 的饥饿处理，胞外酸化率会降低至基础水平，由图3可以看出，α-LA-OA 处理细胞24 h 后，细胞内的基础糖酵解水平已低于其它2 个处理组。随着10 mmol/L 葡萄糖溶液的加入（图3Ⅰ），葡萄糖迅速被分解代谢为丙酮酸，产生乳酸或者CO2，导致细胞的胞外酸化率（ECAR）显著增加。待其稳定后，通过加入抑制剂寡霉素抑制细胞线粒体有氧呼吸的供能途径（图3Ⅱ），使细胞的氧化磷酸化被抑制，所有的葡萄糖及能量底物均进行糖酵解供能，释放出乳酸和CO2，因此胞外酸化率会进一步升高。最后通过加入糖酵解第1 步的抑制剂2-脱氧葡萄糖（图3Ⅲ），完全抑制细胞的糖酵解过程，使胞外酸化率降低到初始水平。

图2 CCK-8 法检测α-LA-OA 处理后HepG2细胞的活力Fig.2 CCK-8 assay for the viability of HepG2 cells after α-LA-OA treatment

图3 α-LA-OA 处理肿瘤细胞后的胞外酸化率变化曲线图Fig.3 Curve of extracellular acidification rate of tumor cells treated with α-LA-OA

根据图3及试剂盒方法可以计算出细胞的糖酵解能力，结果如图4所示。可以看出，α-LA-OA显著降低了细胞的糖酵解能力（P＜0.05），而经过同样处理的α-LA 和对照组对细胞的糖酵解能力并无显著影响（P＞0.05）。

图4 α-LA-OA 处理肿瘤细胞后的糖酵解及糖酵解能力Fig.4 Glycolytic and glycolysis ability of tumor cells treated with α-LA-OA

2.3 α-LA-OA 对线粒体有氧呼吸的影响

用40 μmol/L 的α-LA-OA、α-LA 和对照组处理HepG2 细胞24 h 后，细胞的耗氧量如图5所示。有氧呼吸是指细胞在氧气参与下的一系列生化反应过程，因此有氧呼吸过程的变化可以通过耗氧率的变化反映。不同药物处理后的细胞，经过1 h 的饥饿，细胞耗氧量降低至其基础水平，由图5可以看出，α-LA-OA 及α-LA 处理细胞24 h后，细胞内的基础糖酵解水平均低于对照组。随着ATP 合酶抑制剂，寡霉素（图5Ⅰ）的加入，使细胞用于ATP 合成的耗氧量减少，即此时减少的耗氧是机体用于ATP 合成的耗氧量；待其稳定后，通过加入线粒体氧化磷酸化解偶联剂——三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（图5Ⅱ），破坏线粒体内膜，使大量质子回流，使氧被最大程度的消耗，因此细胞的耗氧率会进一步升高[27]；最后加入呼吸链抑制剂——鱼藤酮-抗霉素A 复合溶液（图5Ⅲ），使线粒体呼吸作用停止，并使其耗氧率降低至由非线粒体呼吸作用产生的水平。

根据图5及试剂盒方法可以计算出基础呼吸值、ATP 产生量，结果如图6所示。可以看出，虽然图5中α-LA-OA 及α-LA 处理组的细胞耗氧率曲线均低于对照组，但经过计算发现，仅α-LAOA 处理组能够显著降低细胞的基础呼吸（P＜0.05），而经过同样处理的α-LA 和对照组对细胞的基础呼吸并无显著影响（P＞0.05）；α-LA-OA 显著降低了线粒体ATP 产生量（P＜0.05），而经过同样处理的α-LA 和对照组对细胞的ATP 产生量并无显著影响（P＞0.05）。

图5 α-LA-OA 处理肿瘤细胞后的耗氧率变化曲线图Fig.5 Curve of oxygen consumption rate of tumor cells treated with α-LA-OA

图6 α-LA-OA 处理肿瘤细胞后的基础耗氧及ATP 产生量Fig.6 Basic oxygen consumption and ATP production of tumor cells treated with α-LA-OA

3 结论

综上所述，本研究证明了α-LA-OA 能够显著降低人肝癌细胞的糖酵解能力和线粒体有氧呼吸能力，并降低ATP 的产生量和基础呼吸（P＜0.05），而经过相同处理的蛋白本身（α-LA）和溶剂对照组均无上述作用。因此，α-LA-OA 能够干预肿瘤细胞的能量代谢过程，通过降低肿瘤细胞基础代谢能力阻断其ATP 供应，为今后抗肿瘤药物的开发提供了新的机遇。