PLIN2通过调控SREBP2促进RAW264.7巨噬细胞脂质蓄积*

蒋思怦， 张 瑞， 李晓歌， 张 荣， 郭东铭， 袁中华

（南华大学心血管疾病研究所，动脉硬化学湖南省重点实验室，湖南省动脉硬化性疾病国际科技创新合作基地，湖南衡阳421001）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发病机制复杂，至今未被完全阐明，其中脂质代谢紊乱和炎症反应被广泛认为是诱导AS 发生发展的原因。低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）经氧化修饰［氧化LDL（oxidized LDL，ox-LDL）］后被巨噬细胞所吞噬，转化为泡沫细胞，大量堆积在血管内皮下，促进动脉粥样斑块的形成与发展［1］。脂滴包被蛋白2（perilipin 2，PLIN2）是围绕在细胞内脂滴表面的主要脂滴相关蛋白之一，高表达在泡沫细胞中［2-3］，对脂滴的合成和降解起着重要的作用，可作为脂质蓄积的标志。大量研究表明，PLIN2 具有一定的促进AS作用［4］，但其具体机制尚未阐明。固醇调节元件结合蛋 白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是一类可激活涉及胆固醇、甘油三酯等生物合成及脂质代谢所需酶转录的转录因子超家族，其中SREBP2广泛存在于各种组织，主要参与胆固醇代谢酶转录的调控［5］。内质网是真核细胞动态的膜细胞器，一旦受到有害因素（如饥饿、病毒感染等）侵袭，大量的错误折叠及未折叠蛋白在内质网腔内募集，将诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。新近研究表明，PLIN2敲除小鼠的ERS 受到显著抑制，同时肝脏中SREBPs 活性降低，血清脂质蓄积水平减少，SREBP2 表达降低［6］，提示 PLIN2 与ERS 和SREBP2 活性具有密切联系。我们前期研究显示，PLIN2 可以促进巨噬细胞中脂滴聚积［7］。因此，本研究旨在探讨PLIN2 是否通过影响ERS 调控SREBP2的表达，从而影响巨噬细胞内脂质蓄积。

材 料 和 方 法

1 主要材料

RAW264.7小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞来自上海生科院细胞生物学研究所。RPMI1640 培养液（苏州巨能世纪公司）；新生胎牛血清（杭州四季青公司）；ox-LDL（广州奕源公司）；游离胆固醇（free cholesterol，FC）检测试剂盒（Applygen）；内质网提取试剂盒（上海贝博生物科技有限公司）；无内毒素质粒提取试剂盒（Omega Bio-tek）；SYBR Green 和Trizol（TIANGEN）；4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA；北京索莱宝公司）；Lipo6000TM转染试剂（上海碧云天公司）；油红O（北京鼎国昌盛公司）；鼠抗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）Ⅰ抗（武汉爱博泰克生物技术有限公司）；鼠抗β-actin Ⅰ抗，兔抗PLIN2、SREBP2 和葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）Ⅰ抗，山羊抗鼠/抗兔IgG Ⅱ抗（Proteintech）；其它试剂均为进口或国产分析纯。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司根据设计合成，见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2 主要方法

2.1 细胞培养及实验分组 将RAW264.7 细胞置于5% CO2、37℃的培养箱中培养，每天换液，当细胞贴壁率达到75%时传代。实验分为4 步。实验一：细胞经 ox-LDL 处理不同时间（0、6、12、24 和48 h），构建泡沫细胞模型［8］。实验二：（1）PLIN2 过表达实验，分为 PLIN2-Con 组（将 pQCXIP 转染入细胞）、PLIN2-Con+ox-LDL 组、HA-PLIN2 组（将 pQCXIP-HAAdipophilin 转染入细胞）和 HA-PLIN2+ox-LDL 组；（2）PLIN2沉默实验，分为siRNA-Con 组（将pSuperscramble siRNA 转染入细胞）、siRNA-PLIN2 组（将pSuper-Adipophilin siRNA 转染入细胞）、siRNAPLIN2+ox-LDL 组和 siRNA-Con+ox-LDL 组。实验三：分为HA-PLIN2 组及siRNA-PLIN2 组。实验四：ERS抑制剂4-PBA 处理实验，分为control 组（空白对照组）、ox-LDL组、4-PBA组和ox-LDL+4-PBA组。

2.2 提取与鉴定质粒 将含pQCXIP、pQCXIP-HAPLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 质粒的菌液解冻混匀，接种在含氨苄西林的琼脂培养基上，在细菌培养箱中培养12～16 h后挑出阳性单菌落置于含氨苄西林的LC 培养液中，37℃摇床震荡18～24 h（220 r/min）。取一部分菌液提取质粒并通过AGE 鉴定，余下已鉴定的菌液再划板挑取阳性单菌落接种于200 mL的LC培养液中，通过质粒提取试剂盒提取质粒，使用紫外分光光度计测量质粒的浓度。

2.3 转染pQCXIP、pQCXIP-HA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 入 RAW264.7细胞 转染前1 d 将RAW264.7 细胞接种于6 孔板中，后放入细胞培养箱中继续培养。用250 μL 的DMEM 培养液稀释上面提取的pQCXIP、pQCXIPHA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 质粒（各 4 μg），并用 250 μL DMEM 培养液稀释10 μL Lipo6000TM转染试剂，均在室温下静置5 min 混匀，后又置于室温中20 min，将混匀液均匀加入6 孔板中。再于细胞培养箱中培养4～6 h 后换为含10%胎牛血清的PRMI-1640 培养液继续培养，1～2 d后可通过Western blot实验检测转染效果。

2.4 Western blot 实验 将收集好的未处理的RAW264.7 细胞或经转染后的RAW264.7 细胞中加入细胞裂解混合液冰上裂解，提取总蛋白。使用BCA 试剂盒对蛋白定量。制备10%分离胶和5%浓缩胶，蛋白经SDS-PAGE 分离后转移至PDVF 膜上；转膜结束后经脱脂牛奶封闭，后分别加入相应Ⅰ抗，摇床震荡孵育6～8 h（4℃过夜）；接着加入对应的Ⅱ抗，摇床摇动孵育2 h（室温），开始显影。

2.5 油红O 染色 配制油红O 工作液（油红O 储存液∶双蒸水=6∶4），使用4%多聚甲醛（30 min）固定细胞后使用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 min；将油红 O 染液加入24 孔板中，每孔至少1 mL，1 h 后吸出染液，PBS再洗涤3次，每次10 min；后用苏木素染核5 s，最后用PBS洗涤3次。在显微镜下拍片并保存。

2.6 细胞免疫荧光 使用4%多聚甲醛（30 min）固定细胞，PBS清洗3次；使用0.1%Trition X-100（每孔300～500 μL）处理24 孔板中的细胞15～30 min，PBS清洗 3 次，每次 5 min；使用 300～500 μL 的 10% 胎牛血清封闭1 h 后孵育对应的Ⅰ抗（4℃过夜），PBS 清洗3 次，每次5 min；接着Ⅱ抗孵育（常温），PBS 清洗3 次，每次 5 min；使用 1 mg/L 的 DAPI 染核 30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；最后使用抗荧光淬灭剂进行封片，在荧光显微镜下拍摄并保存。

2.7 细胞内及内质网膜组分中FC 的测定 （1）提取细胞内内质网：细胞悬浮后1 000×g离心10 min，丢弃上清液；加入500 μL 试剂A 后放于冰上10 min，将匀浆在 1 000×g和 11 000×g（4℃）下分别离心5 min 和10 min，收集上清液；后于30 000×g（4℃）条件下离心 45 min，收集沉淀；加入 400 μL 的试剂 B 在30 000×g（4℃）下再次离心45 min，收集的沉淀即为内质网样品。（2）检测FC：在培养细胞的培养瓶和制备的内质网膜组分中分别加入150 和100 μL 的裂解混合液，2 000×g离心5 min 后收集30 μL 上清液，余下裂解液使用BCA 法进行蛋白定量；将5 nmol/L 胆固醇标准品以无水乙醇稀释后设置浓度梯度；96 孔板中每孔加入190 μL R1+R2 工作液（R1∶R2=4∶1），后每孔分别加入10 μL标准品、空白对照溶液或待测样品（37℃，20 min）；使用酶标仪测量每孔吸光度（A），绘出标准曲线，根据标准曲线测出胆固醇浓度，再用蛋白浓度进行校正。

2.8 RT-qPCR 实验 收集各组细胞，按照Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，去除其中混杂的DNA 及DNase，逆转录合成 cDNA，合成第 1 链 cDNA 采用20 μL 体系，反应程序为：42℃ 15 min，95℃ 3 min。50 μL 两步法 PCR 程序为：95℃ 15 min；95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 25 s，40 个循环。以 β-actin 为内参照，用2-ΔΔCt法计算SREBP2 mRNA的相对表达量。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0 软件进行制图和统计分析。结果均以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ox-LDL 处理不同时间对SREBP2和PLIN2蛋白水平的影响

Western blot 实验结果显示，24 h 内，ox-LDL 呈时间依赖性增加PLIN2 和SREBP2 表达水平（P＜0.05），但 24 h 后 SREBP2 蛋白水平开始降低，见图1；同时24 h后出现细胞死亡、伪足增多现象，见图2。因此，本研究选择ox-LDL孵育细胞时间为24 h。

2 PLIN2对SREBP2和HMGCR 表达、脂质蓄积及FC含量的影响

Western blot 及 RT-qPCR 实验结果显示，与PLIN2-Con 组相比，HA-PLIN2 组 PLIN2 和 SREBP2的mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平显著上升（P＜0.05）；与 PLIN2-Con+ox-LDL 组相比，HAPLIN2+ox-LDL 组 PLIN2 和 SREBP2 的 mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平显著增加（P＜0.05），图3A 及图4A、B。与siRNA-Con 组相比，siRNA-PLIN2组PLIN2和SREBP2 的mRNA 和蛋白水平及HMGCR的蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与siRNA-Con+ox-LDL 组相比，敲减PLIN2可显著逆转 ox-LDL 诱导的SREBP2 mRNA和蛋白水平及HMGCR蛋白水平的升高（P＜0.05），见图3B及图4C、D。

Figure 1.Western blot was used to determine the protein levels of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages exposed to ox-LDL for different time（0，6，12，24 and 48 h）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 h.图1 ox-LDL处理不同时间对PLIN2和SREBP2蛋白表达的影响

Figure 2.Micrograph of RAW264.7 macrophages cultured with ox-LDL for different time（A：0 h；B：24 h；C：48 h）.The death of the cells increased after ox-LDL treatment for 24 h.The scale bar=100 μm.图2 ox-LDL处理不同时间后细胞的形态

油红O 染色结果显示，HA-PLIN2+ox-LDL 组较ox-LDL 组脂质蓄积增加，而 siRNA-PLIN2+ox-LDL 组较ox-LDL组脂质蓄积减少，见图5。

FC检测结果显示，与siRNA-PLIN2+ox-LDL组相比，HA-PLIN2+ox-LDL组细胞内及内质网上的FC含量均显著增加（P＜0.05），见图6。

3 PLIN2 对 GRP78 蛋白水平及 SREBP2 核移位 的影响

Western blot结果显示，HA-PLIN2组细胞内GRP78表达较siRNA-PLIN2组显著增加（P＜0.05），见图7。

免疫荧光结果显示，与control 组相比，siRNAPLIN2组绿色荧光主要分布于细胞质，在核内很少表达，而HA-PLIN2组细胞核内出现强荧光，见图8。

4 ERS抑制剂4-PBA对GRP78、SREBP2和HMGCR表达的影响

Western blot 实验结果显示，4-PBA 组 GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平较control 组显著降低（P＜0.05）；与 ox-LDL 组 相比 ，4-PBA+ox-LDL 组GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图9。

RT-qPCR 实验结果显示，4-PBA 组 SREBP2 的mRNA 水平较control 组降低（P＜0.05）；与 ox-LDL 组相比，4-PBA+ox-LDL 组SREBP2 mRNA 水平显著降低（P＜0.05），见图10。

讨 论

随着人民生活的日益提高，AS源性心血管疾病的发病率逐年增加，严重威胁着人们身心健康。但AS发病机制复杂，其中脂质代谢异常是导致AS发生发展的主要因素之一［9］。相关研究表明，PLIN2能够增加巨噬细胞内甘油三酯和胆固醇酯含量，抑制胆固醇流出，促进胆固醇蓄积及泡沫细胞形成［7，10］。同时也有报道证实，在AS 斑块区域，PLIN2 表达显著增加［11］，提示PLIN2 可能通过促进泡沫细胞形成进而影响AS 发生发展。但是PLIN2 调节脂质蓄积的具体机制仍不明确。本研究表明，PLIN2 能够通过ERS 调控 SREBP2 表达和活性，促进 HMGCR 表达和胆固醇合成，进而诱导巨噬细胞脂质蓄积。

Figure 3.Effects of PLIN2 on the protein levels of SREBP2 and HMGCR.A：the RAW264.7 macrophages were transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h；B：the RAW264.7 macrophages were transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PLIN2-Con group；#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group；&P＜0.05 vs ox-LDL group；▲P＜0.05 vs siRNA-Con group；△P＜0.05 vs siRNA-PLIN2 group；☆P＜0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.图3 PLIN2对SREBP2和HMGCR蛋白表达的影响

Figure 4.Effects of PLIN2 on the mRNA expression of SREBP2.A，B：the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h；C，D：the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PLIN2-Con group；#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group；&P＜0.05 vs ox-LDL group；▲P＜0.05 vs siRNA-Con group；△P＜0.05 vs siRNAPLIN2 group；☆P＜0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.图4 PLIN2对SREBP2 mRNA表达的影响

Figure 5.Lipid droplets in RAW264.7 macrophages detected by oil red O staining.The scale bar=50 μm.图5 油红O染色观察PLIN2对脂滴变化的影响

既往研究表明，细胞内胆固醇丰富时，SREBPs锚定于内质网；但细胞胆固醇水平较低时，SREBPs被site-1 及site-2 蛋白酶切割并释放，转移至细胞核与LDL 受体或HMGCR 合成酶的基因操纵子结合并促进其表达［5，12］。其中，SREBP2 位于内质网中作为膜结合蛋白，可通过蛋白酶水解后释放N 端结构域进入细胞核，与固醇反应元件结合，激活SREBP2 靶基因HMGCR的转录，进而促进细胞内胆固醇合成。Vergnes 等［13］发 现，在 小鼠 胚胎 中 敲除SREBP2，HMGCR 表达水平显著降低，胆固醇的生物合成减少。新近研究报道，在小鼠中敲除PLIN2能够降低SREBP2 表达，抑制其活性，减少脂质蓄积［6］，提示PLIN2 与SREBP2 存在相互作用，但其具体机制尚不明确。本研究显示，在RAW246.7 细胞中过表达PLIN2，能够促进并激活 SREBP2，增加SREBP2 核移位，上调HMGCR 表达，提高细胞内及内质网上FC水平，导致细胞脂质蓄积；降低PLIN2 水平则出现相反的结果。这说明PLIN2 可通过激活SREBP2 增加HMGCR 的表达，促进细胞内胆固醇合成进而引起细胞脂质蓄积。

Figure 6.Effects of PLIN2 on intracellular free cholesterol content（A）and free cholesterol content in endoplasmic reticulum（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs siRNA-PLIN2+Ox-LDL group.图6 PLIN2对细胞内及内质网上游离胆固醇含量的影响

Figure 7.Effects of PLIN2 on the protein level of GRP78 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group.图7 PLIN2对GRP78蛋白水平的影响

Figure 8.Effects of PLIN2 on the nuclear translocation of SREBP2 detected by immunofluorescence staining.PLIN2 was visualized by FITC-conjugated Affinipure（green），and nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=50 μm.图8 PLIN2对SREBP2核转位的影响

Figure 9.Effects of 4-PBA on the protein levels of GRP78，SREBP2 and HMGCR in each group detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs 4-PBA group；△P＜0.05 vs ox-LDL group.图9 4-PBA对GRP78、SREBP2和HMGCR蛋白水平的影响

Figure 10.Effects of 4-PBA on the mRNA expression of SREBP2 in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs 4-PBA group；△P＜0.05 vs ox-LDL group.图10 4-PBA处理后对SREBP2 mRNA表达的影响

内质网是调节胆固醇含量的重要细胞器［14］，通过感知细胞内胆固醇含量而调节胞内胆固醇水平［15］。ERS 发生能够促进胆固醇负荷，增加脂质蓄积和泡沫细胞形成，说明ERS 与AS 发生发展有密切联系［16-17］。GRP78作为内质网伴侣蛋白，在调节ERS的动态平衡中发挥关键作用，是ERS的标志［18］。ERS发生时，ERS 相关蛋白 GRP78 与 SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）-SREBP复合物分离，激活SREBP2，促进其发挥生物活性［19］。此外，Chen 等［20］观察到 PLIN2 在胰腺 β 细胞中可参与ERS 调节。由此我们猜想，PLIN2 可能通过ERS调控SREBP2 从而影响RAW264.7 巨噬细胞脂质蓄积。本研究表明，过表达PLIN2 能促进GRP78 表达，说明过表达PLIN2 能够引起ERS 的发生。ERS 特异性抑制剂 4-PBA 降低 SREBP2 及 HMGCR 表达，进一步表明PLIN2可通过ERS 影响SREBP2活性，从而调控RAW264.7细胞内脂质蓄积。

综上所述，PLIN2可促进RAW264.7细胞脂质蓄积，其机制是其诱导ERS的发生，激活SREBP2，从而促进脂质蓄积。但鉴于本工作是以RAW264.7 巨噬细胞为研究对象进行的体外细胞实验，与临床疾病的发生发展有一定的区别，因此在AS 发展中PLIN2 对SREBP2的具体作用机制仍有待进一步研究。