谷子SiPRR37基因对光温、非生物胁迫的响应特点及其有利等位变异鉴定

贾小平 李剑峰 张 博 全建章 王永芳 赵 渊 张小梅 王振山 桑璐曼 董志平,*

谷子基因对光温、非生物胁迫的响应特点及其有利等位变异鉴定

贾小平1,*李剑峰1张 博1全建章2王永芳2赵 渊1张小梅1王振山1桑璐曼1董志平2,*

1河南科技大学农学院, 河南洛阳 471023;2河北省农林科学院谷子研究所/ 国家谷子改良中心, 河北石家庄 050035

从谷子品种延谷11号克隆生物钟基因, 通过生物信息学分析、组织特异性表达分析、4种不同光温组合条件的昼夜表达模式分析以及对NaCl、ABA、PEG、低温、Fe 5种非生物胁迫的响应特点分析, 揭示参与谷子光温互作调控以及应对非生物胁迫的作用机制; 并对160份谷子材料重测序检测基因的突变位点进行单倍型分析, 探究该基因对谷子主要农艺性状的影响。结果表明,基因蛋白质编码区(sequence coding for amino acids in protein, CDS)全长2247 bp, 编码748个氨基酸, 含有REC和CCT 2个结构域, 基于PRR37蛋白的系统进化分析发现, 谷子与糜子、高粱、玉米亲缘关系最近; 启动子预测分析发现,启动子区存在光、温、生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯、干旱和盐胁迫等多种应答元件。相对表达量从高到低依次为根、穗颈、穗、顶叶、次顶叶、茎秆; 4个光温组合条件均只在光照期出现1个表达峰, 无论高温(27℃)还是低温(22℃), 短日照相比长日照表达峰均要提前, 无论长日照还是短日照, 低温(22℃)相比高温(27℃)表达峰均要提前; NaCl、低温(15℃)胁迫能够抑制表达, PEG模拟干旱胁迫和Fe胁迫能够诱导基因表达,参与了ABA信号传导过程。位于CDS区的10个SNP将160份谷子材料分为19个单倍型, 其中3个单倍型(Hap_7、Hap_10、Hap_19)是改善穗部性状的有利单倍型。谷子基因表达具有昼夜节律性, 同时受光周期和温度调控, 并且参与了谷子对盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫和铁胁迫的应答反应, 同时与抽穗期和多个穗部性状相关, 在开展谷子高产分子辅助选育中具有一定应用潜力。

谷子;; 光温组合; 非生物胁迫; 表达分析; 单倍型

伪应答调控蛋白(pseudo-response regulators, PRRs)基因属于CCT基因家族中的PRR亚家族, 所编码蛋白的氨基端含有1个PRR结构域, 羧基端含有1个CCT结构域, 这2个结构域被1个不太保守的可变域分割[1-2]。作为生物钟核心组分, PRRs基因广泛参与植物光周期调控开花、抵御非生物胁迫及生物量积累等多个生长发育过程[3-5]。

是从水稻中克隆的1个非常关键的生物钟基因, 与控制光周期敏感性的主效QTL Hd2密切相关, 影响株高、开花期和每穗小穗数[6-7];的天然突变促进了水稻向亚洲高纬度地区的扩张, 使其地理适应性和种植面积都得到提升[8-10]。大麦、小麦和高粱与同源, 同样在对应作物光周期调控开花过程中发挥重要功能, 影响区域适应性[11-13]。PRR37蛋白提前终止、CCT结构域和PRR结构域中的错义突变会影响作物对光周期的敏感性, 进而影响表型性状, 因此可以把作为改变生态适应性的靶点, 通过选择特定的碱基突变类型(单倍型)从而达到所需的适应性表型, 发掘该基因有利等位变异, 在作物广适应性高产分子辅助选择育种中展现良好应用前景[5,11,14-16]。如水稻开花期与表达水平显著相关, 利用可以增强水稻光温敏感性, 从而实现对开花期的调节[17]。除了与生态适应性密切相关,的直系同源基因还参与了拟南芥对干旱胁迫的抵御过程, 其许多靶基因能够负调控植物ABA以响应干旱胁迫[18-20]。基因的作用靶点还包括fer1、fer3和fer4 三种铁蛋白, 在植物铁过量应激反应中具有保护作用[21]。此外低温诱导可使及其他生物钟基因形成不同的可变剪切体, 导致不同的转录本产生, 通过负调控抗冷基因(C-repeat-binding factor)表达来响应冷胁迫[20,22-23]。

目前对基因的研究主要集中于光周期调控开花、逆境胁迫响应机制方面, 有关该基因在禾本科作物光温互作调控中的作用机制尚未见报道, 同时在非生物胁迫中的作用机制研究局限于拟南芥、水稻几种模式植物, 在C4作物中的研究比较缺乏。谷子(L.)是我国的传统杂粮作物, 具有基因组较小(约515 Mb)、籽粒营养价值高、生育期短、抗旱性强、耐贫瘠和高光效等优点, 已经成为北方干旱半干旱地区重要的粮食作物以及C4禾谷类作物的理想模型[24-27]。谷子对光温反应敏感, 自然界存在丰富的光温敏感型变异材料, 是揭示C4作物光温敏感性形成分子机制的合适对象[28]。有关谷子光温敏感性研究较少, 主要包括光温敏感性指标筛选、光周期敏感性相关性状QTL定位等方面[29-36]。谷子全基因组序列测定及大量转录组数据的公布为利用反向遗传学方法快速克隆光温敏感性关键基因提供了便利, 这对揭示谷子光温敏感性形成的分子机制具有极大的促进作用, 因此本研究利用RT-PCR技术克隆谷子生物钟关键基因, 设置不同光温组合条件、不同非生物胁迫条件分析该基因的表达规律, 并通过对160份谷子材料重测序检测基因突变位点, 进行单倍型效应分析, 以期揭示参与谷子光温互作调控和抵御非生物胁迫的可能机制, 确定其对主要农艺性状的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究用于基因克隆及表达分析的谷子品种为来自陕西的延谷11号, 该品种对光温敏感, 是研究春谷品种光温敏感性的理想材料。用于重测序及单倍型分析的160份谷子材料见附表1。

1.2 谷子SiPRR37基因的克隆

首先通过检索NCBI数据库获得1条注释为基因的谷子mRNA序列(XM_022824614), 将该基因命名为, 以此序列为模板设计3对特异引物用于基因扩增(表1)。将延谷11号饱满种子种植于口径为10 cm×10 cm装有营养土的塑料盆中, 在自然条件下生长至五叶期时采集顶叶, 液氮速冻, 然后用Ultrapure RNA Kit (康为世纪生物科技有限公司)提取总RNA, 用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (宝日医生物技术(北京)有限公司)反转录合成第一链cDNA, 用3对特异性引物分段扩增目的基因, 扩增体系包括稀释10倍的cDNA模板1 μL、2×EsMasterMix (Dye) (康为世纪生物科技有限公司) 10 μL、10 μmol L-1正、反向引物各0.5 μL, 最后用ddH2O补足到20 μL。PCR扩增程序为94℃预变性5 min; 94℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸90 s, 35个循环; 72℃延伸5 min。用EasyPure Quick Gel Extraction Kit (北京全式金生物技术有限公司)纯化回收PCR产物, 然后连接到pBM16A克隆载体(北京艾德莱生物科技有限公司), 再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑选阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 特异性引物

1.3 谷子SiPRR37基因的生物信息学分析

利用在线分析工具SubLoc软件(http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi)分析基因亚细胞定位; 用NCBI的CDD数据库(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)搜索谷子SiPRR37蛋白的保守结构域; 用DISPHOS (http://www.dabi. temple.edu/disphos/)预测谷子SiPRR37蛋白的磷酸化位点。利用 DNAMAN 5.0软件将谷子SiPRR37蛋白序列与NCBI数据库中下载的其他32个物种的PRR37蛋白序列进行多序列比对, 用MEGA 6.05软件构建分子系统发育树。从phytozome数据库(https:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载谷子2号染色体基因上游49,117,628~49,119,628 bp之间序列, 用启动子分析软件plantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析基因启动区顺式作用元件。

1.4 谷子SiPRR37基因的表达分析

将延谷11号种子种于口径10 cm×10 cm装有营养土的塑料方盆中, 总计种植115盆, 每盆种植4株。将其中3盆放在低温短日照(low temperature short day, LTSD, 22℃、9 h光/15 h暗)条件下培养至抽穗, 然后用剪刀剪取穗、穗颈、茎秆、顶叶、次顶叶和根, 放入液氮速冻, 每个样品3次重复, 用于基因的组织特异性表达分析。

将64盆放在自然条件下长至三叶期后分别转至高温短日照(high temperature short day, HTSD, 27℃、9 h光/15 h暗)、低温短日照(low temperature short day, LTSD, 22℃、9 h光/15 h暗)、高温长日照(high temperature long day, HTLD, 27℃、15 h光/9 h暗)、低温长日照(low temperature long day, LTLD, 22℃、15 h光/9 h暗) 4个培养箱培养, 每个培养箱16盆, 2个重复, 3周后昼夜24 h内每隔3 h取植株顶端2片叶液氮速冻, 取样时间点为6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00、0:00、3:00, 所取样品用于基因昼夜表达分析。

剩余的48盆分为6组, 1个对照(CK)组, 5个胁迫处理组, 每组8盆, 在培养室萌发3周后分别进行200 mmol L-1NaCl、100 μmol L-1ABA、20% PEG-6000、600 μmol L-1EDTA-Fe和15℃冷胁迫处理。NaCl、EDTA-Fe和PEG-6000处理采用浇灌法, ABA处理采用叶面喷洒法, 将整盆植株移入15℃冰箱进行冷胁迫处理。分别取各处理组和对照组(CK)在处理前(0 h)和处理后0.5、1、2、4、8、16、24 h每株顶端2片叶于液氮速冻, 培养室温度为25℃, 光照条件为14 h光/10 h暗, 所取样品用于基因在非生物胁迫条件下的表达分析。

上述所有样品RNA提取、反转录同1.2, 将反转录好的cDNA作为Real-time PCR的模板, 用表1中的SiActin引物和RtPRR37引物分别扩增内参基因和基因特异片段, 每个样品做3个重复, 扩增体系及循环程序参照宝日医生物技术(北京)有限公司的TB Green Premix ExII (Tli RNaseH Plus)试剂说明书, 首先配制10 µL扩增体系, 包含cDNA模板1 μL、TB Green Premix ExII (Tli RNaseH Plus) 5 μL、10 μmol L-1的RtPRR37正向和反向引物各1 μL、ddH2O 2 μL。使用Roche Light Cycler 96实时定量PCR仪, 采用两步法PCR反应程序, 扩增程序为95℃预变性30 s; 95℃变性30 s, 58℃退火30 s, 共40个循环。分析得到的扩增曲线、溶解曲线, 并计算∆∆CT值, 采用2−ΔΔCT计算相对表达量。

1.5 SiPRR37基因单倍型效应分析

从160份谷子材料重测序数据中获得基因SNP位点, 利用dnasp 5软件对基因编码区的SNP位点进行单倍型分析, 利用本实验室于2015、2016连续2年在海南乐东、河南洛阳、吉林吉林市、公主岭市调查的160份谷子材料8个农艺性状表型数据进行单倍型效应分析[30]。

2 结果与分析

2.1 谷子SiPRR37基因的克隆及生物信息学分析

首先提取延谷11号叶片总RNA, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA质量较好, 无明显降解, 可以用于后续的反转录试验(图1)。以反转录合成的第一链cDNA为模板, 用PRR37-1、PRR37-2和PRR37-3 3对特异性引物分段扩增基因, 均获得预期大小片段(图2-A, B)。将3个扩增片段测序后经过拼接得到谷子基因含有完整编码区域的cDNA序列, 该序列长度为2953 bp, 包含2247 bp的CDS区域, 编码748个氨基酸(附图1)。

1, 2: 提取的两管RNA。1, 2: two tubes of RNA extracted.

图2 SiPRR37基因的RT-PCR产物电泳结果

M: marker DL2000; A: PRR37-1, PRR37-2扩增产物; B: PRR37-3扩增产物。

M: marker DL2000; A: amplified products of PRR37-1 and PRR37-2; B: amplified product of PRR37-3.

生物信息学分析发现, 谷子SiPRR37蛋白定位于细胞核中, 该蛋白含有2个明显的结构域, 即REC和CCT结构域(图3); SiPRR37蛋白的多肽链中只有丝氨酸(Ser)可能发生磷酸化, 85个丝氨酸残基中较易发生磷酸化的有14个, 占16.47% (附图2)。

在NCBI数据库中下载与谷子SiPRR37蛋白具有直系同源关系的大麻(XP_ 030488228.1)、枣(XP_015877113.1)、蓖麻(XP_015578380.1)、澳洲棉(KAA3464109.1)、番木瓜(XP_021910105.1)、葡萄(XP_010658157.1)等32种植物的PRR37蛋白序列, 采用NJ法构建分子系统进化树发现, 谷子与糜子亲缘关系最近, 其次是高粱和玉米, 这4种C4作物聚为一个小亚群, 与同为禾本科作物的小麦和水稻聚为一个较大的群, 其余物种聚在另一个大群里(图4)。

分析基因上游启动子区发现, 除了TATA-box、CCAAT-box核心启动子元件外, 还有8个光响应元件、1个低温响应元件、2个赤霉素响应元件、1个生长素响应元件、2个ABA响应元件和2个茉莉酸甲酯响应元件, 说明基因受光温和多种激素调控。此外启动子区还发现2个参与干旱、盐等逆境胁迫的作用元件, 说明在谷子应对逆境胁迫中可能发挥作用(表2)。

2.2 SiPRR37基因的组织特异性表达分析

通过分析基因在延谷11茎秆、根、穗颈、顶叶、次顶叶和穗6个部位的相对表达量发现, 在抽穗后,基因在根中表达量最高, 茎秆中表达量最低, 相对表达量从高到低依次为根>穗颈>穗>顶叶>次顶叶>茎秆(图5)。

2.3 SiPRR37基因在4种光温组合条件下的表达分析

在4种光温组合条件下基因均在光照期出现1个表达峰, 且光照期的表达量明显高于黑暗期, 说明该基因受光诱导(图6-A~D)。此外无论低温(22℃)还是高温(27℃),在短日照条件的表达峰均比长日照提前, 低温条件短日照在光照6 h表达量最高, 长日照在光照9 h表达量最高; 高温条件短日照在光照9 h表达量最高, 长日照在光照12 h表达量最高。同时可以看出, 温度的提高使的表达峰无论长日照条件还是短日照条件均发生推迟。说明在受光周期调控的同时也受温度的影响。

表2 SiPRR37启动子区顺式作用元件分析

柱上不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。

Values followed by different uppercase and lowercase letters above the bar represent significant difference at the 0.01 and 0.05 proba­bility levels, respectively.

2.4 谷子SiPRR37基因对非生物胁迫的响应

基因在NaCl胁迫处理24 h内表达量均显著或极显著低于对照, 说明盐胁迫能够明显抑制基因的表达(图7-A); 在ABA处理2~12 h表达水平和对照产生极显著差异, 说明参与了ABA信号传导过程(图7-B); 在PEG胁迫处理4 h、24 h与对照表达量无显著差异, 其余时间点表达量均极显著高于对照, 说明可以被干旱胁迫诱导表达(图7-C)。

15℃低温胁迫处理除了在处理12 h被诱导表达、处理18 h 表达水平接近于对照, 其余时间点表达量均显著或极显著低于对照, 说明总体上15℃低温胁迫处理使表达受到抑制(图7-D)。Fe胁迫处理的24 h内除了处理1 h基因的表达量与对照无显著差异, 其余时间点表达水平均显著或极显著高于对照(图7-E), 说明铁胁迫处理可以诱导基因的表达, SiPRR37蛋白有fer1、fer3和fer4 3种铁蛋白作用靶点, 推测其在铁过量应激反应中具有保护作用。

A: 低温条件不同光周期对基因的影响; B: 短日照条件不同温度对基因的影响; C: 长日照条件不同温度对基因的影响; D: 高温条件不同光周期对基因的影响。长日照: 6:00–21:00光照, 0:00–6:00和21:00–0:00为黑暗; 短日照: 6:00–15:00光照, 0:00–6:00和15:00–0:00为黑暗。LTSD: 低温短日照; LTLD: 低温长日照; HTSD: 高温短日照; HTLD: 高温长日照。柱上不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。

A: the effect of different photoperiods ongene under low temperature condition; B: the effect of different temperatures ongene under short-day condition; C: the effect of different temperatures ongene under long-day condition; D: the effect of different photoperiods ongene under high temperature condition. Long day: 6:00–21:00 light, 0:00–6:00 and 21:00–0:00 dark; Short day: 6:00–15:00 light, 0:00–6:00 and 15:00–0:00 dark. LTSD: low temperature short day; LTLD: low temperature long day; HTSD: high temperature short day; HTLD: high temperature long day. Different uppercase and lowercase letters above the bar represent significant difference at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

A: 盐胁迫; B: ABA渗透胁迫; C: PEG模拟干旱胁迫; D: 低温胁迫; E: 铁胁迫。柱上不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。

A: salt stress; B: ABA osmotic stress; C: PEG simulated drought stress; D: low-temperature stress; E: iron stress. Different uppercase and lowercase letters above the bars represent significant difference at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

2.5 SiPRR37基因单倍型效应分析

从160份谷子重测序数据中提取获得14,343 bp的基因核苷酸序列, 包括978 bp的5¢非翻译区、2247 bp的编码区、10,440 bp的内含子区和678 bp的3¢非翻译区。对基因结构进行分析发现, 该基因编码区有7个外显子、6个内含子。经对160份谷子材料基因序列进行比对共获得47个SNPs, 其中外显子区10个SNPs, 包括8个错义突变, 错义突变频率为80% (表3)。

对基因外显子区的10个SNP位点进行单倍型分析, 共发现19个单倍型, 160份谷子材料在19个单倍型中分布不均衡, 出现频率最高的单倍型是Hap_1, 包括84个谷子品种, 占所有品种的52.5%; 8个单倍型(Hap_3、Hap_4、Hap_8、Hap_10、Hap_12、Hap_17、Hap_18和Hap_19)只包含1个品种, 占所有品种的5% (附表2)。对19个单倍型进行表型效应分析发现, Hap_19的抽穗期、叶片数、穗长、穗码数显著高于其他单倍型, 但是千粒重最低(图8-A, C, D, F, H); Hap_10的穗粒重、穗粗、穗重显著高于其他单倍型(图8-B, E, G); Hap_7的千粒重最高(图8-H)。

3 讨论

本研究从延谷11克隆的基因与在水稻和高粱中已报道的、、等基因一样, 均属于CCT基因家族中的PRR亚家族[3,13,16,37]。基于PRR37蛋白序列的系统进化分析表明,、与谷子有较近的进化关系, 推测它们可能具有相同或类似的功能, 能对节律性变化的环境条件作出应答反应, 参与植物开花期的调控[8]。基因通过感受外界光周期和温度的变化而调控抽穗开花, 对水稻的环境适应性有重要影响, 是控制水稻抽穗期、株高和每穗小穗数的主效基因[5-8]; 而高粱与籽粒成熟度和茎秆甜度相关[17]; 小麦对抽穗期、株高和千粒重有显著影响[38]。表明是一个多效基因, 同时控制多个农艺性状。本研究通过单倍型效应分析发现,基因与谷子抽穗期、穗码数、穗粒重、千粒重等性状相关, 同样具有多效性, 与其他作物报道的基因研究结果一致[2,5-6,17,38,40]。但是的表达模式与存在差异, 虽然三者的表达都是光依赖性的, 属于光周期途径中调控作物开花的主要基因[7,13],在长日照下具有早晨和黄昏2个表达峰, 在短日照下仅有早晨表达峰, 而无论高温还是低温、长日照还是短日照, 只在光照期出现1个表达峰, 在暗期表达峰消失, 其昼夜节律性表达与拟南芥直系同源基因相似[37]。产生这种结果的原因可能和取样间隔时间有关, 本研究昼夜取样间隔时间为3 h, 较疏的取样密度可能会漏掉潜在的表达峰。本研究发现, 温度的提高使的表达峰无论长日照条件还是短日照条件均发生推迟, 但不影响短日照条件的表达峰比长日照提前, 说明光周期对表达起主要调控作用, 但其同时也受温度的影响,可能参与了谷子光温互作调节过程。我们近期发现光周期和温度对谷子生长发育具有明显的互作效应, 长日照条件温度升高使抽穗期延迟, 而短日照条件温度升高使抽穗期缩短, 高温的作用受到光周期的制约[39],基因在此互作过程中起到怎样的作用值得深入研究。

表3 SiPRR37基因在160份谷子材料中检测到的SNP位点

柱上不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。

Bars marked with different uppercase and lowercase letters represent significant difference at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

PRRs家族基因还广泛参与逆境胁迫调节过程。有研究表明温度主要影响生物钟基因的可变剪切方式, 低温可以使PRRs家族基因形成不同的转录本来影响生物钟功能和增强植物对冷胁迫的耐受性[22]。在冷胁迫中,、、作为负调节因子来调节抗冷基因的表达[20,23]。有研究发现, 水稻受到冷胁迫刺激后, 会促进的表达[41], 但是本研究中基因在15℃低温胁迫下表达被显著抑制, 这表明PRRs家族基因在不同的作物中对低温胁迫的应对方式存在差异。铁也是一种非生物胁迫因子, 土壤中过量的铁会损害作物根系细胞, 降低生长能力, 比缺铁时更影响产量。有研究表明具有fer1、fer3和fer4三种铁蛋白作用靶点, 而铁蛋白在作物中能够储存过量的铁, 因此推测参与了铁胁迫调节过程[18,21]。本研究发现, 铁胁迫处理可诱导基因的表达, 推测该基因也具有铁蛋白作用靶点, 在作物铁过量应激反应中具有保护作用。PRRs家族基因也参与植物对干旱胁迫的响应[42]。在水稻中, 干旱可以抑制的表达, 诱导的表达, 对、和基因的影响较小[43]; 在大豆中,的直系同源基因在干旱胁迫下表达减弱, 仅的表达增高, 在响应干旱胁迫中发挥作用。本研究发现, 干旱胁迫可以诱导的表达, 说明基因参与了谷子干旱胁迫的应答反应, 与水稻不同。ABA在植物对逆境的适应性反应中起着重要作用, 已有的研究表明, PRRs家族的基因与ABA调控基因有部分重叠,能够结合到ABA调控基因启动子上抑制、、等基因的表达, 这些基因的表达又能促进表达, 从而能够形成调节ABA信号传导的调节环, 以增加植物抗逆性[44]。本研究发现,在ABA胁迫1 h后开始响应表达, 随后多数时间点表达受到抑制, 推测通过某种作用机制参与了ABA介导的信号传导过程。

4 结论

从延谷11克隆得到基因2953 bp的cDNA序列, 包含2247 bp的完整CDS区域, 编码748个氨基酸;基因含有REC和CCT 2个结构域, 属于CCT基因家族的PRR亚家族成员, 与玉米PRR37、高粱SbPRR37、糜子PRR37蛋白亲缘关系较近;基因表达具有昼夜节律性, 且同时受光周期和温度调控, 可能参与了谷子光温互作调节过程;基因受干旱胁迫和铁胁迫诱导, 受盐胁迫和低温胁迫抑制, 参与了对非生物胁迫的应答;基因和抽穗期及多个穗部性状相关, 具有多效性, 鉴定出Hap_19、Hap_10、Hap_7三个用于谷子生育期和穗部性状改良的有利单倍型。

附表和附图 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuow xb.aspx。

[1] Makino S, Kiba T, Imamura A, Hanaki N, Nakamura A, Suzuki T, Taniguchi M, Ueguchi C, Sugiyama T, Mizuno T. Genes encoding pseudo-response regulators: insight into His-to-Asp phosphorelay and circadian rhythm in Arabidopsis thaliana., 2000, 41: 791–803.

[2] 李剑峰, 李婷, 贾小平. PRRs家族功能基因的研究进展. 植物遗传资源学报, 2019, 20: 1399–1407. Li J F, Li T, Jia X P. Advances on unlocking the functional basis of PRRs family genes., 2019, 20: 1399–1407 (in Chinese with English abstract).

[3] Farré Eva M, Kay S A. PRR7 protein levels are regulated by light and the circadian clock in., 2007, 52: 548–560.

[4] Matsushika A, Makino S, Kojima M, Mizuno T. Circadian waves of expression of thefamily of pseudo-response regulators in: insight into the plant circadian clock., 2000, 41: 1002–1012.

[5] Koo B H, Yoo S C, Park J W, Kwon C T, Lee B D, An G, Zhang Z Y, Li J J, Li Z C, Paek N C. Natural variation inregulates heading date and contributes to rice cultivation at a wide range of latitudes., 2013, 6: 1877–1888.

[6] Nakagawa H, Yamagishi J, Miyamoto N, Motoyama M, Yano M, Nemoto K. Flowering response of rice to photoperiod and temperature: a QTL analysis using a phenological model., 2005, 110: 778–786.

[7] Liu C, Song G Y, Zhou Y H, Qu X F, Guo Z B, Liu Z W, Jiang D M, Yang D C.andare the major genes for general combining ability of DTH, PH and SPP in rice., 2015, 5: 12803.

[8] Gao H, Jin M N, Zheng X M, Chen J, Yuan D Y, Xin Y Y, Wang M Q, Huang D Y, Zhang Z, Zhou K N, Sheng P K, Ma J, Ma W W, Deng H F, Jiang L, LiuS J, Wang H Y, Wu C Y, Yuan L P, Wan J M., a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity and regional adaptation in rice., 2014, 111: 16337–16342.

[9] Xue W, Xing Y, Weng X, Zhao Y, Tang W, Wang L, Zhou H, Yu S, Xu C, Li X, Zhang Q. Natural variation inis an important regulator of heading date and yield potential in rice., 2008, 40: 761–767.

[10] Fujino K, Yamanouchi U, Yano M. Roles of thegene controlling heading date for adaptation to the northern limits of rice cultivation., 2012, 126: 611–618.

[11] Turner A, Beales J, Faure S, Dunford R P, Laurie D A. The pseudo-response regulatorprovides adaptation to photoperiod in barley., 2005, 310: 1031–1034.

[12] Beales J, Turner A, Griffiths S, Snape J W, Laurie D A. A pseudo-response regulatoris misexpressed in the photoperiod insensitivemutant of wheat (L.)., 2007, 115: 721–733.

[13] Murphy R L, Klein R R, Morishige D T, Brady J A, Rooney W L, Miller F R, Dugas D V, Klein P E, Mullet J E. Coincident light and clock regulation of() controls photoperiodic flowering in sorghum., 2011, 108: 16469–16474.

[14] Shrestha R, Gómez-Ariza J, Brambilla V, Fornara F. Molecular control of seasonal flowering in rice, arabidopsis and temperate cereals., 2014, 114: 1445–1458.

[15] Lister D L, Thaw S, Bower M A, Jones H, Charles M P, Jones G, Smith L M J, Howe C J, Brown T A, Jones M K. Latitudinal variation in a photoperiod response gene in European barley: insight into the dynamics of agricultural spread from ‘historic’ specimens., 2009, 36: 1092–1098.

[16] Klein R R, Miller F R, Dugas D V, Brown P J, Burrell A M, Klein P E. Allelic variants in thegene and the human-mediated dispersal and diversification of sorghum., 2015, 128: 1669–1683.

[17] Liu C, Qu X, Zhou Y, Song G, Abiri N, Xiao Y, Liang F, Jiang D, Hu Z, Yang D.confers an expanded regulation of the diurnal rhythms of the transcriptome and photoperiodic flowering pathways in rice., 2018, 41: 630–645.

[18] Liu T, Carlsson J, Takeuchi T, Newton L, Farré E M. Direct regulation of abiotic responses by the Arabidopsis circadian clock component., 2013, 76: 101–114.

[19] Fukushima A, Kusano M, Nakamichi N, Kobayashi M, Hayashi N, Sakakibara H, Mizuno T, Saito K. Impact of clock associatedpseudo-response regulators in metabolic coordination., 2009, 106: 7251–7256.

[20] Nakamichi N, Kusano M, Fukushima A, Kita M, Ito S, Yamashino T, Saito K, Sakakibara H, Mizuno T. Transcript profiling of anpseudo response regulator arrhythmic triple mutant reveals a role for the circadian clock in cold stress response., 2009, 50: 447–462.

[21] Briat J F, Ravet K, Arnaud N, Duc C, Boucherez J, Touraine B, Cellier F, Gaymard F. New insights into ferritin synthesis and function highlight a link between iron homeostasis and oxidative stress in plants., 2010, 105: 811–822.

[22] Grundy J, Stoker C, Carré I A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants., 2015, 6: 1–15.

[23] Seo P J, Mas P. STRESSing the role of the plant circadian clock., 2015, 20: 230–237.

[24] Li H W, Li C H, Pao W K. Cytogenetical and genetical studies of the interspecific cross between the cultivated foxtail millet,(L.) Beauv., and the green foxtail milletL., 1945, 37: 32–54.

[25] Brutnell T P, Lin W, Swartwood K, Goldschmidt A, Jackson D, Zhu X G, Kellogg E, Van Eck J.: a model for C4photosynthesis., 2010, 22: 2537–2544.

[26] Lata C, Gupta S, Prasad M. Foxtail millet: a model crop for genetic and genomic studies in bioenergy grasses., 2013, 33: 328–343.

[27] 王海岗, 贾冠清, 智慧, 温琪汾, 董俊丽, 陈凌, 王君杰, 曹晓宁, 刘思辰, 王纶, 乔治军, 刁现民. 谷子核心种质表型遗传多样性分析及综合评价. 作物学报, 2016, 42: 19–30. Wang H G, Jia G Q, Zhi H, Wen Q F, Dong J L, Chen L, Wang J J, Cao X N, Liu S C, Wang L, Qiao Z J, Diao X M. Phenotypic diversity evaluations of foxtail millet core collections., 2016, 42: 19–30 (in Chinese with English abstract).

[28] Diao X M, Jia G Q. Origin and domestication of foxtail millet. In: Doust A, Diao X M, eds. Genetics and Genomics of Setaria. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Cham: Springer Press, 2017. pp 61–72.

[29] 贾小平, 李剑峰, 全建章, 王永芳, 董志平, 张博, 袁玺垒. 不同光周期条件下谷子农艺性状的光周期敏感性评价. 植物遗传资源学报, 2018, 19: 919–924. Jia X P, Li J F, Quan J Z, Wang Y F, Dong Z P, Zhang B, Yuan X L. Evaluation of photoperiod sensitivity of agronomic traits of foxtail millet varieties () under different photoperiod conditions., 2018, 19: 919–924 (in Chinese with English abstract).

[30] 贾小平, 袁玺垒, 李剑峰, 张博, 张小梅, 郭秀璞, 陈春燕. 不同光温条件谷子资源主要农艺性状的综合评价. 中国农业科学, 2018, 51: 2429–2441. Jia X P, Yuan X L, Li J F, Zhang B, Zhang X M, Guo X P, Chen C Y. Comprehensive evaluation of main agronomic traits of millet resources under different light and temperature conditions., 2018, 51: 2429–2441 (in Chinese with English abstract).

[31] Margarita M H, Wang X W, Barbier H, Brutnell T P, Devos K M, Doust A N. Genetic control and comparative genomic analysis of flowering time in(Poaceae).:, 2013, 3: 283–295.

[32] Ni X M, Xia Q J, Zhang H B, Cheng S, Li H, Fan G Y, Guo T, Huang P, Xiang H T, Chen Q C, Li N, Zou H F, Cai X M, Lei X J, Wang X M, Zhou C S, Zhao Z H, Zhang G Y, Du G H, Cai W, Quan Z W. Updated foxtail millet genome assembly and gene mapping of nine key agronomic traits by resequencing a RIL population., 2017, 6: 1–8.

[33] Doust A N, Mauro-Herrera M, Hodgeand J G, Stromsk J. The C4model grass Setaria is a short day plant with secondary long day genetic regulation., 2017, 8: 1–10.

[34] 谢丽莉. 谷子光周期敏感相关性状的QTL定位与分析. 河南农业大学硕士学位论文, 河南郑州, 2012. Xie L L. QTL Mapping and Analysis of the Photoperiod-sensitive Traits in Foxtail Millet. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2012 (in Chinese with English abstract).

[35] Jia G Q, Huang X H, Zhi H, Zhao Y, Zhao Q, Li W J, Chai Y, Yang L F, Liu K Y, Lu H Y, Zhu C R, Lu Y Q, Zhou C C, Fan D L, Weng Q J, Guo Y L, Huang T, Zhang L, Lu T T, Feng Q, Hao H F, Liu H K, Lu P, Zhang N, Li Y H, Guo E H, Wang S J, Wang S Y, Liu J R, Zhang W F, Chen G Q, Zhang B J, Li W, Wang Y F, Li H Q, Zhao B H, Li J Y, Diao X M, Han B. A haplotype map of genomic variations and genome-wide association studies of agronomic traits in foxtail millet ()., 2013, 45: 957–961.

[36] Zhang K, Fan G Y, Zhang X X, Zhao F, Wei W, Du G H, Feng X L, Wang X M, Wang F, Song G L, Zou H F, Zhang X L, Li S D, Ni X M, Zhang G Y, Zhao Z H. Identification of QTLs for 14 agronomically important traits inbased on SNPs generated from high-throughput sequencing.:, 2017, 7: 1587–1594.

[37] Mizuno T, Nakamichi N. Pseudo-response regulators (PRRs) or true oscillator components (TOCs)., 2005, 46: 677–685.

[38] Guo Z, Song Y, Zhou R, Ren Z, Jia J. Discovery, evaluation and distribution of haplotypes of the wheatgene., 2010, 185: 841–851.

[39] 贾小平, 袁玺垒, 李剑峰, 王永芳, 张小梅, 张博, 全建章, 董志平. 不同光温条件谷子光温互作模式研究及基因表达分析. 作物学报, 2020, 46: 1052–1062.Jia X P, Yuan X L, Li J F, Wang Y F, Zhang X M, Zhang B, Quan J Z, Dong Z P. Photo-thermal interaction model under different photoperiod-temperature conditions and expression analysis ofgene in foxtail millet (L.)., 2020, 46: 1052–1062 (in Chinese with English abstract).

[40] Campoli C, Shtaya M, Davis S J, Korff M V. Expression conservation within the circadian clock of a monocot: natural variation at barley Ppd-H1 affects circadian expression of flowering time genes, but not clock orthologs., 2012, 12: 97.

[41] 徐江民, 姜洪真, 林晗, 黄苗苗, 付巧丽, 曾大力, 饶玉春. 水稻参与生物钟基因表达调控以及逆境胁迫响应. 植物学报, 2016, 51: 743–756. Xu J M, Jiang H Z, Lin H, Huang M M, Fu Q L, Zeng D L, Rao Y C.participates in the expression regulation of circadian clock genes and response to stress in rice., 2016, 51: 743–756 (in Chinese with English abstract).

[42] Marcolino-Gomes J, Rodrigues F A, Fuganti-Pagliarini R, Bendix C, Nakayama T J, Celaya B, Molinari H B C, Neves de Oliveira M C, Harmon F G, Nepomuceno A. Diurnal oscillations of soybean circadian clock and drought responsive genes., 2014, 9: e86402.

[43] 李佳, 刘运华, 张余, 陈晨, 余霞, 余舜武. 干旱对水稻生物钟基因和干旱胁迫响应基因每日节律性变化的影响. 遗传, 2017, 39: 837–846. Li J, Liu Y H, Zhang Y, Chen C, Yu X, Yu S W. Drought stress modulates diurnal oscillations of circadian clock and drought- responsive genes inL., 2017, 39: 837–846 (in Chinese with English abstract).

[44] Kurup S, Jones H D, Holdsworth M J. Interactions of the deve­lopmental regulatorwith proteins identified from developingseeds., 2000, 21: 143–155.

Responsive features ofto photoperiod and temperature, abiotic stress and identification of its favourable allelic variations in foxtail millet (L.)

JIA Xiao-Ping1,*, LI Jian-Feng1, ZHANG Bo1, QUAN Jian-Zhang2, WANG Yong-Fang2, ZHAO Yuan1, ZHANG Xiao-Mei1, WANG Zhen-Shan1, SANG Lu-Man1, and DONG Zhi-Ping2,*

1College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China;2Institute of Millet, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / National Millet Improvement Center, Shijiazhuang 050035, Hebei, China

In this study, the clock genewas cloned from the foxtail millet variety Yangu 11, and bioinformatics analysis, tissue specific expression analysis, diurnal expression patterns analysis under four different photo-thermal combinational conditions and responsive characteristics analysis to five abiotic stresses such as NaCl, ABA, PEG, low temperature and Fe were performed to reveal the mechanisms thatparticipated in regulating of photo-thermal interaction and coped with abiotic stresses. Mutation sites ofwere detected by re-sequencing of 160 millet materials, which were used for haplotype analysis to explore the effect ofon main agronomic traits. The results showed that the CDS length ofgene was 2247 bp, which encoded 748 amino acids and contained REC and CCT domains. The phylogenetic analysis based on PRR37 proteins showed that foxtail millet had the closest relationship with broomcorn millet, sorghum and maize. Promoter prediction analysis found that various responsive elements to light, temperature, auxin, GA, ABA, MeJA, drought and salt stresses were detected in promoter region of. The decreasing order of relative expression level ofwas root, panicle neck, panicle, parietal leaf, secondary parietal leaf and stem. Under four photo-thermal combinational conditions,gave only one expression peak during the light period, and regardless of high temperature (27℃) or low temperature (22℃), the expression peak advanced under short-day condition compared to long-day condition, regardless of long-day or short-day, the expression peak advanced at low temperature (22℃) compared to high temperature (27℃). The expression ofwas inhibited by NaCl and low temperature (15℃) stresses, induced by PEG-simulated drought stress and Fe stress.participated in ABA signaling transduction process. The 10 SNPs in CDS region ofdivided 160 millet materials into 19 haplotypes, of which Hap_7, Hap_10 and Hap_19 were favorable haplotypes for improving panicle traits.exhibited circadian expression, and was regulated by photoperiod and temperature simultaneously.participated in the responses of foxtail millet to salt stress, low temperature stress, drought stress and Fe stress. At the same time,was correlated with heading stage and multiple panicle traits, showing certain application potential in high-yield molecular-assisted breeding of foxtail millet.

foxtail millet;; photo-thermal combinations; abiotic stress; expression analysis; haplotype

10.3724/SP.J.1006.2021.04139

本研究由国家自然科学基金项目(31471569)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31471569).

贾小平, E-mail: jiaxiaoping2007@163.com; 董志平, E-mail: dzp001@163.com

2020-06-25;

2020-10-14;

2020-11-20.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201120.1412.004.html