灰葡萄孢对腐霉利的抗性分子机制及快速检测技术

郑 远, 沈 瑶, 汪汉成, 戴德江,沈 颖, 吴鉴艳, 张传清*,

(1. 浙江农林大学 农业与食品科学学院，杭州 311300；2. 浙江省植物保护检疫与农药管理总站，杭州 310004；3. 贵州省烟草科学研究院， 贵阳 550081)

由灰葡萄孢Botrytis cinerea 引起的灰霉病是影响草莓产量和质量的主要病害之一[1]。灰葡萄孢能够侵染草莓植株地上部分的所有器官，包括叶片、花瓣、果实等，其中对果实的危害尤为严重[2]，造成的产量损失达1 0%～3 0%，严重时高达50%以上，甚至绝棚[3]。目前，化学防治是防治灰霉病的主要手段。腐霉利是一种二甲酰亚胺类杀菌剂 (dicarboximide fungicides，DCFs)，由于其对灰葡萄孢有特效，因此被大量用于果蔬灰霉病的防治[4]，但随着该药剂的长期大量、连续使用，灰葡萄孢对其抗性问题也日益严重。相关抗性报道已有很多：赵虎等研究表明，江苏省草莓灰霉病菌对腐霉利的抗性频率达54%以上[5]；宋晰等研究表明，内蒙古灰霉病菌对腐霉利的平均抗性频率高达90%以上[6]。然而，腐霉利作为浙江省用于草莓灰霉病防治的主要杀菌剂之一，却鲜有相关研究报道。因此，明确浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利的抗性现状，对建立合理的用药策略具有重要意义。

几种病原菌如灰葡萄孢[7]、链格孢Alternaria alternata[8]和粗糙脉孢霉Neurospora crassa[9]等在双组分组氨酸激酶 (two component histidine kinase，TCHK) 上的突变研究表明，TCHK 是二甲酰亚胺类杀菌剂的主要作用靶点。严蕾燕等[10]通过敲除灰葡萄孢TCHK 传递系统途径上5 个关键基因 BcOS1、BcOS2、BcOS4、BcOS5 和BRRG-1，并测定基因敲除突变体的药剂敏感性发现，只有BcOS1 基因敲除突变体对DCFs 表现抗性，其他4 个基因敲除突变体对该类药剂表现更为敏感。因此，严蕾燕等认为BcOS1 是DCFs的靶标位点，该基因上的点突变可能会导致病原菌对DCFs 产生抗性。目前报道的灰葡萄孢抗药性菌株BcOS1 基因上有I365N/R/S、V368F、Q369P/H、N373S 和T447S 等突变类型，其中除了Q369P 突变会导致灰葡萄孢对DCFs 产生低、中或高水平抗性外，其余突变类型均会导致灰葡萄孢对DCFs 产生低水平抗性[11]。

根据菌丝生长速率法或孢子萌发法测定病原菌对药剂的敏感性，是判定灰葡萄孢是否为抗药性菌株的传统方法[12]。虽然传统检测方法得出的结果可靠，但是检测周期长，步骤繁琐。环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是一种操作简单、精确度高、反应速度快且特异性高的检测方法[13-14]，可以用于检测特定的病原菌种类。由于作用靶标发生点突变是目前植物病原菌产生抗药性的主要机制，因此，近年来已有学者根据病原菌抗药性分子机制，利用碱基错配原则检测DNA 片段上单碱基的差异，将LAMP 技术用于检测由点突变引起的病原菌对药剂的抗性[15-17]。

本研究测定了从浙江省5 个地区采集的200株灰葡萄孢对腐霉利的抗性，分析了抗性分子机制，在此基础上建立了可以特异性检测灰葡萄孢对腐霉利高抗基因型的LAMP 检测技术，以期为腐霉利的进一步使用及灰葡萄孢的抗药性治理提供理论依据和技术手段。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2017—2018 年从浙江省5 个地区 (宁波市、台州市、湖州市、杭州市和嘉兴市) 的草莓种植基地采集灰霉病样品，参考杜颖等[11]的方法进行单孢分离纯化，共获得200 株灰葡萄孢，其中宁波50 株，台州37 株，湖州37 株，杭州32 株，嘉兴44 株。将获得的单孢菌株编号 (地点缩写 +B + 序号)，保存至斜面冻存管中，于 −4 ℃保存备用。

1.2 供试药剂、试剂与培养基

供试药剂：95%腐霉利 (procymidone) 原药由浙江新安化工集团股份有限公司提供。

LAMP 体系试剂：(8 U/μL) Bst DNA Polymerase购自诺唯赞生物科技有限公司；10 × Thermopol Buffer、10 mmol/L dNTP Mix 购自 TaKaRa 生物工程公司、甜菜碱 (Betaine) 和羟基萘酚蓝 (HNB) 购自Sigma 公司；25 mmol/L MgCl2购自生工生物工程股份有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)：称取去皮土豆200 g，煮沸后过滤，加入20 g 葡萄糖和20 g琼脂，加无菌水定容至1 L，121 ℃高压灭菌30 min，备用。

1.3 灰葡萄孢对腐霉利的抗性检测

参考赵虎等[5]的区分剂量法，分别利用5、20 和100 μg/mL 作为灰葡萄孢对腐霉利敏感性水平的区分浓度。在5 μg/mL 上不能生长的灰葡萄孢是敏感菌株；在5 μg/mL 上能生长、20 μg/mL上不能生长的为低抗菌株；在20 μg/mL 上能生长、100 μg/mL 上不能生长的为中抗菌株；在100 μg/mL 上能生长的为高抗菌株。分别将200 个菌株活化到PDA 平板上，取菌落边缘的菌饼 (直径为5 mm) 转移至新鲜的PDA 平板上，培养3 d 后打取直径5 mm 的菌饼接种到含不同质量浓度腐霉利的PDA 培养基平板上。每个处理重复3 次。置于23 ℃下黑暗培养3 d 后，统计在含不同质量浓度腐霉利PDA 板上生长的菌株数量，按公式(1) 分别计算灰葡萄孢对腐霉利表现低水平、中水平和高水平抗性菌株的频率。

式中：X—抗药性频率，%；N1—抗药性菌株数；N2—供试总菌株数。

1.4 腐霉利抗感菌株的BcOS1 基因的分析

根据灰葡萄孢组氨酸激酶基因BcOS1 序列(基因登录号：AF396827.2)，参考杜颖等[11]的文献合成4 对引物，记为S1～S4 (表1) 用于扩增BcOS1 基因全长。采用25 μL 反应体系，包含以下组分：12.5 μL 2 × Tag 聚合酶，上、下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL。PCR 扩增参数为：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s；55～62 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min，34 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 扩增产物的测序结果由SeqMan 11.2 和EditSeq 7.1 生物软件进行分析。

1.5 LAMP 引物的设计

以灰葡萄孢对腐霉利抗性菌株BLB-13 的BcOS1 基因 (基因登录号：MT375849) 含有Q369P 点突变的序列为模板，使用在线软件Primer Explore (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html) 设计检测引物，记为S5 (表1)。引物干粉用ddH2O 溶解后置于 −4 ℃冰箱中保存，备用。

1.6 LAMP 扩增反应体系的优化

参考胡小然等[18]LAMP 扩增反应体系，分别对扩增体系中的各反应组分浓度进行优化：Bst DNA 聚合酶浓度依次设为0.08、0.16、0.24 和0.32 U/μL；Mg2+浓度依次设为 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mmol/L；dNTP 浓度依次设为 0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L；FIP 和 BIP 的浓度分别依次设为 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 μmol/L；F3 和B3 的浓度分别依次设为0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol/L；甜菜碱浓度依次设为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L。每个处理 3 个重复，试验重复3 次，下同。

1.7 LAMP 扩增反应条件的优化

参考胡小然等[18]LAMP 扩增反应条件进行优化。将反应最优体系溶液分别在59、60、61、62、63、64、65 和66 ℃恒温条件下反应60 min，然后在最佳反应温度下分别反应10、20、30、40、50、60、70 和80 min。扩增反应结束后，观察反应管颜色变化，以确定最佳反应时间和反应温度。

1.8 LAMP 扩增反应的灵敏度

利用真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒 (上海生物工程有限公司) 提取菌株BLB-13 (高抗) 菌丝DNA，测定其质量浓度后进行10 倍梯度稀释, 用作LAMP 扩增反应灵敏度测试的模板。质量浓度梯度分别设置为 10 × 100、10 × 10−1、10 × 10−2、10 × 10−3、10 × 10−4、10 × 10−5、10 × 10−6和 10 ×10−7ng/μL。为了比较 LAMP 和常规 PCR 之间的灵敏度，使用引物F1 和R1 (表1)，扩增BcOS1基因上包含第369 位约1719bp 的DNA 片段，PCR 反应程序如1.4 节所述。

1.9 LAMP 扩增反应的特异性

为了评估LAMP 的特异性和准确性，分别以敏感、I365S/N 和Q369P + N373S 突变类型的菌株的DNA 作为模板，每种突变类型各选2 株菌株。在最佳反应条件下，通过观察反应管颜色变化判断LAMP 扩增的特异性。

2 结果与分析

2.1 灰葡萄孢对腐霉利的抗性

从浙江省5 个地区采集分离的200 株灰葡萄孢对腐霉利的总抗性频率高达71.5%，其中低水平抗性菌株 (LR) 100 株，频率为50%；中水平抗性菌株 (MR) 38 株，频率为19%；高水平抗性菌株 (HR) 5 株，频率为2.5% (图1)。

2.2 腐霉利抗感菌株的BcOS1 序列比对分析

通过比对32 个抗性菌株的碱基序列发现在BcOS1 基因上存在3 种突变类型 (表2)。低抗菌株和中抗菌株的第365 位密码子由ATC 突变成AGC或AAC，导致氨基酸由异亮氨酸 (Ile，I) 突变成丝氨酸 (Ser，S) 或天冬酰胺 (Asn，N)；高抗菌株的第369 和373 位密码子同时发生突变，导致第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Gln，Q) 突变成脯氨酸(Pro，P)，第373 位氨基酸由天冬酰胺 (Asn，N)突变成丝氨酸 (Ser，S)。

表2 灰葡萄孢BcOS1 碱基序列及氨基酸的比较Table 2 Comparison of base sequence and amino acids of different strains of BcOS1

2.3 LAMP 检测体系的优化

最终确定LAMP 检测体系的最佳浓度组分(表 3)：Bst DNA 聚合酶为 0.16 U/μL，Mg2+为3 mmol/L，dNTP 为1 mmol/L，内引物FIP 和BIP均为 1.2 μmol/L，外引物 F3 和 B3 均为 0.4 μmol/L，甜菜碱为0.6 mmol/L。

表3 LAMP 体系Table 3 LAMP component

2.4 LAMP 检测体系的反应条件

结果表明：当温度在59～61 ℃时，反应管颜色不变；当温度到达62 ℃时，反应管颜色开始变蓝；当温度到达63 ℃时，反应管颜色明显变蓝，因此确定63 ℃为最佳反应温度 (图2)。在63 ℃下，当反应进行50 min 时，反应管变化最明显(图3)。因此，确定该体系的最佳反应条件为反应温度63 ℃、时间50 min。

2.5 LAMP 检测的灵敏度

以BLB-13 菌株的DNA 为模板，10 倍梯度稀释DNA。结果表明：当DNA 质量浓度为10 ×10−4ng/μL 时，LAMP 反应管颜色仍为紫色，表明此时LAMP 反应已检测不到DNA，说明该检测体系的最低检测限为 10 × 10−3ng/μL。而常规PCR 的最低检测限仅为 10 × 10−2ng/μL，可见，LAMP 检测比常规 PCR 的灵敏度高 10 倍 (图 4)。

2.6 LAMP 检测特异性

结果(图5)表明，敏感菌株、低水平和中水平抗药性菌株中的Ⅰ类突变和Ⅱ类突变的反应管均呈阴性反应，颜色无明显变化，只有高水平抗药性菌株，即第 Ⅲ 类突变的反应管由紫色变为天蓝色，表明该LAMP 检测具有较好的特异性。

3 结论与讨论

灰霉病是影响草莓产量和质量的主要病害。二甲酰亚胺类杀菌剂 (DCFs) 腐霉利作为草莓灰霉病防治的主要药剂之一，有报道指出，草莓灰葡萄孢已对其产生严重的抗性[16]，然而浙江省内却缺乏相关研究报道。本研究通过区分剂量法测定了浙江省5 个地区共200 株草莓灰葡萄孢对腐霉利的抗性水平，总抗性频率为71.5%。与辽宁、山西省等地相比，抗性频率相对较低[11,19]，这可能与不同地区施药水平不同有关。同时本研究发现，浙江省灰葡萄孢对腐霉利的抗性菌株以低水平抗性为主，占抗性菌株的69.9%。因此本研究认为，腐霉利可继续用于浙江省草莓灰霉病的防治，但前提是要加强灰葡萄孢对腐霉利的抗性监测。

Lerous 等[20]通过对双组分组氨酸激酶(TCHK) 的基因测序比对发现，田间灰葡萄孢抗性菌株的BcOS1 第365 位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸，认为该点突变可能影响了病原菌对二甲酰亚胺类杀菌剂的敏感性。Oshima 等[9]也在灰葡萄孢对该类药剂的抗性菌株上发现同样的突变类型，认为该基因序列的突变导致了菌株对药剂产生了抗性。本研究通过比对敏感、抗性菌株BcOS1基因序列表明，草莓灰葡萄孢抗腐霉利菌株有3 种突变类型：第Ⅰ类和第Ⅱ类分别为第365 位氨基酸由异亮氨酸 (I) 突变成丝氨酸 (S) 或天冬酰胺(N)，即I365S/N；第 Ⅲ 类包含两个突变位点，分别为第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Q) 突变成脯氨酸(P) 和第373 位氨基酸由天冬酰胺 (N) 突变成丝氨酸 (S)，即Q369P + N373S。过去已有研究者报道，这3 种突变类型可能是灰葡萄孢对二甲酰亚胺类杀菌剂产生抗性的原因[21-23]。此外，本研究发现，I365S/N 突变类型菌株的抗性水平为低抗或中抗，而Q369P + N373S 突变类型菌株的抗性水平为高抗。Muhammad 等[21]也报道了 Q369P + N373S 突变会导致灰葡萄孢对腐霉利产生高水平抗性。而杜颖等[11]研究中显示，BcOS1 基因编码的氨基酸上发生Q369P 突变后，菌株不仅表现为低抗，还可能表现中高或高抗。因此N373S 突变在灰霉病菌对腐霉利产生高水平抗性中的贡献还需进一步研究。

在抗药性分子机制分析的基础上，本研究建立了可以快速检测灰葡萄孢对腐霉利高抗菌株Q369P 的技术。传统的抗药性检测主要是通过组织或单孢分离的方法分离培养病原菌，再根据菌丝生长速率法或孢子萌发法来判定是否为抗性菌株[12]，该方法检测周期长，步骤繁琐。后来研究者根据抗药性的分子机制设计错配引物扩增病原菌的DNA，通过PCR 技术可特异性区分敏感和抗药性菌株[24]，但也存在耗时长、检测成本高等不足，且不适用于田间的快速检测。本研究建立的快速检测体系可在63 ℃恒温条件下，用时50 min 便可完成整个检测，并且具有较高的灵敏度，该体系理论上能检测到低至质量浓度为10 ×10−3ng/μL 水平的基因组 DNA，是普通 PCR 反应的10 倍。Zou 等[25]报道过一种可在30s 内快速提取病原真菌DNA 的方法，在未来可将该方法与LAMP 检测技术相结合，从而实现在田间对灰葡萄孢更为快速、简单的检测。