生长分化因子5基因多态性与退变性腰椎滑脱症椎间盘真空征的相关性研究

闫少凯，李育成，林景春要爱琴杜玄，温玉梅

(张家口市第二医院 1.CT室，2.骨科，3.急诊科，4.检验科，5.内二科，河北张家口 075000)

椎间盘真空征是影像学概念，表现为椎间盘线性或类圆形密度缺失影[1-2]。椎间盘真空征指椎间盘退变形成低压力的空腔，导致周围组织产生的气体通过裂隙进入空腔，该征象是椎间盘退变的典型征象。既往研究多关注椎间盘真空征的形成机制、原因和影像学特点，少有关注其遗传易感性。生长分化因子5(growth differentiate factor5，GDF5)在软骨形态发生及关节形成中有重要作用[3]，被证实具有促进椎间盘组织修复[4]、间充质细胞集结、Ⅱ型胶原蛋白基因表达等作用[5]。现有研究发现，骨关节疾病与GDF5基因单核酸多态性之间存在密切关联[6-7]。但少有GDF5基因多态性与椎间盘真空征的相关研究，鉴于此，本研究筛选退变性腰椎滑脱症患者为样本，选取rs143383位点检测GDF5基因多态性，通过统计学分析探讨GDF5 rs143383位点基因多态性是否为椎间盘真空征的易感因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究已经获得张家口市第二医院伦理机构批准，连续性选择2017年1月～2018年1月就诊的206腰椎滑脱症患者为研究对象，所有患者张家口市市区及周边地区居民，均知情同意本研究并签署同意书。纳入标准：①经MRI或CT证实为腰椎退变性滑脱症；②有完整的影像学及临床资料；③汉族，年龄>18周岁。排除标准：①崩裂性滑脱、椎管肿瘤、强直性脊柱炎、脊髓感染等；②既往有手术或创伤史；③多节段病变。根据CT椎间盘真空现象评估标准[8](脊柱矢状位见一个或多个线性密度缺失影，轴位见类圆形的密度缺失影)，将患者分为真空征组和非真空征组。

1.2 GDF5基因多态性检测

1.2.1 静脉血全基因组DNA提取

采集患者禁食水12 h外周静脉血3 mL置于2% EDTA抗凝试管中，取100 μL样本，加入红细胞裂解液混匀，冰浴15 min，4℃离心3 min，弃上清，加入5% Chelez 100 200 μL充分混匀，56℃孵育20 min，震荡10 s，离心2 min，取上清储存于-20℃低温冰箱保存备用。取DNA液60 μL，应用AU1001核酸提取仪及配套试剂(北京百泰克公司)提取DNA，以Tris-HC1做空白对照，UV7500双光束紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)鉴定DNA纯度和完整性，取吸光度(A260/280 nm)值在1.6-1.8，浓度>50 ng/μL的 DNA 样品待检。

1.2.2 基因多态性分型

GenBank数据库查找基因GDF5基因，Premier 5.0软件设计引物，引物合成由上海天昊公司完成。PCR反应体系为25 μL，含有60 ng DNA，2.5 μL dNTPs(2 mmol/L)，PCR扩增反应条件：94℃ 预变性5 min，94℃变性30 s, 55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸5 min。取出扩增产物25 μL，4℃保存，琼脂糖凝胶电泳，FR-250电泳仪(上海复日公司) 扫描并拍照。采用iMLDR法，取上述PCR扩增产物10 μL，使用美国应用生物公司(ABI)开发的SNaPshot技术进行GDF5 rs143383位点基因多态性测定。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行数据分析，采用SHEsis软件对GDF5 rs143383位点基因进行Hardy-Weinberg平衡检验，P>0.05为符合遗传平衡吻合度。真空征组与非真空征组的组间、男女之间基因型频率、等位基因频率分布差异采用x2检验，采用Logistic回归分析处理GDF5 rs143383位点基因多态性与退变性腰椎滑脱症伴椎间盘真空征的相关性。所有统计均采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 基线资料比较

206例患者中，真空征组39例，非真空征组167例，真空征组年龄大于非真空征组(P<0.05)，椎间盘真空征患者的家族史比例高于非真空征组(P<0.05)。两组性别、体质量指数(body mass index,BMI)、工作类型、临床表现、Meyerding分级、腰椎外伤史、随访时间比较，均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者的基线资料比较

2.2 GDF5 rs143383基因多态性与椎间盘真空征发生的相关性

206例患者GDF5 rs143383基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.569、0.531，均>0.05)，具有群体代表性，可进行遗传学分析。真空征组与非真空征组的基因频率分布、等位基因频率差异显著(P<0.05)，显性模型(TTVSTC+CC)比较差异显著(2=9.068，P=0.003，OR=1.535，95%CI：1.382-1.689)，隐性模型(TT+TCVSCC)比较无统计学差异(2=1.586，P=0.208，OR=0.539，95%CI：0.485-1.021)，见表2。

表2 GDF5 rs143383基因频率分布的组间差异[例(%)]

2.3 不同性别之间GDF5 rs143383基因多态性

女性GDF5 rs143383基因频率分布、等位基因频率与男性差异明显(P<0.05)，显性模型(TTVSTC+CC)比较差异显著(2=9.754，P=0.002，OR=1.035，95%CI：1.002-1.139)，隐性模型(TT+TCVSCC)比较无差异(2=1.074，P=0.300，OR=0.531，95%CI：0.478-1.009)，见表3。

2.4 腰椎滑脱症患者发生椎间盘真空征的风险因素分析

以是否患有椎间盘真空征为因变量(0=否，1=是)，建立多元Logistic回归模型，以年龄(连续性变量)、性别(赋值：1=男，2=女)、椎间盘真空征家族史(赋值：0=无，1=有)、BMI(连续性变量)、工作类型(赋值：1=脑力，1=体力)、Meyerding分级(赋值：1= I度，2= II度，3=Ⅲ度)、腰椎外伤史(赋值：0=无，1=有)、GDF5基因多态性(赋值：1=TT基因型，2=TC基因型，3=CC基因型)为应变量，结果显示：年龄、工作类型、椎间盘真空征家族史、GDF5基因多态性与椎间盘真空征的发生独立相关，见表4。进一步校正年龄、性别等混杂因素影响，rs143383位点携带TC基因型个体发生椎间盘真空征的风险较低(OR=0.603，95%CI：0.264-0.952，P=0.021)，携带TT基因型个体发生椎间盘真空征的风险明显增高(OR=1.725，95%CI：1.261-4.990，P=0.000)。

表4 椎间盘真空征的Logistic分析结果

3 讨论

脊柱真空征指发生在椎体、椎间盘、关节间隙以及椎管内的气体积聚现象，常人椎间盘真空征发生率为1.0%～3.0%，椎间盘真空征的发生与脊柱退行性病变密切相关，约20.0%的老年腰腿痛患者中可检出椎间盘真空征[9]。退变性腰椎滑脱是临床常见的退变性腰椎疾病，此类患者椎间盘真空征的发生率较高，达10.40%，真空征可导致椎间隙塌陷，并导致滑脱椎体手术复位效果失败[10]。退变性腰椎滑脱症患者椎间隙前凸角度、高度丢失，导致周围韧带松弛，活动幅度加大，进而加速椎间盘、周围韧带、肌肉和椎小关节的劳损性退变，对抗椎体前移的力量降低。随着年龄的增长、脊椎的退变性发展，髓核中水分的不断丢失，椎间盘局部出现裂隙，应力分布发生改变，导致椎间隙塌陷和椎体滑脱继续进展。发展到退变性滑脱中晚期，椎间盘裂隙逐渐增大，周围组织产生的气体通过裂隙不断进入空腔，形成椎间盘真空征[11-12]。

脊椎退变性疾病被证实与多种基因多态性有关，目前发现的具有多态性的相关基因有维生素D受体[13]、金属基质蛋白酶[14]、白介素[15]等。GDF5是促进软骨发育、形成的成骨蛋白，主要表达于软骨细胞聚集期、软骨核以及关节形成区域，主要通过Cx43介导的缝隙连接细胞间信号通路调节、促使间充质细胞聚集向软骨方向分化，具有调控骨骼发育和关节形成的作用。Walsh等[16]采用GDF5基因治疗退变性腰椎间盘疾病，发现治疗后椎间盘纤维软骨细胞数量明显增加，蛋白多糖及II型胶原mRNA表达活跃，提示GDF5具有修复椎间盘的作用。GDF5基因突变可导致常染色体隐性遗传，表现为先天软骨发育不良。GDF5基因多态性与骨关节病有着密切的联系，现有研究显示GDF5基因多态性与成人女性身高[17]、先天性髋骨发育不良[18]、退变性腰椎间盘疾病[19]的发生有关，但目前少有GDF5与退变性腰椎滑脱症椎间盘真空征的相关性研究。rs143383位点单核普酸多态性是目前GDF5基因多态性研究中最多、与骨关节病关系最为密切的位点之一，本研究rs143383位点等位基因频率和基因型分布在真空征组和非真空征组均有显著差异，提示GDF5作为骨骼系统及软组织中重要的生长调控因子，其基因多态性可能与退变性腰椎滑脱症患者椎间盘真空征的发生和发展相关，同时也验证了rs143383位点可能是与椎间盘真空征存在关联的微效应位点。GDF5属TGF-β超家族，GDF5可特异性与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合形成异源二聚体复合物[20-21]，将信号转导至细胞核内，调节特定基因转录[22-23]。相关研究显示GDF5通过P38MAP激酶信号转导途径促进骨祖细胞向软骨细胞分化[24]，还可通过激活促分裂原活化蛋白激酶p38、ERK1/2活性促使黄韧带细胞向成骨细胞分化，并上调碱性磷酸酶活性以及骨钙素蛋白表达，形成矿化结节[25]。rs143383位点T等位基因过表达可下调GDFS基因转录活性，减少间充质细胞向软骨细胞分化，使关节软骨细胞生成数量减少，导致蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量减少，下调腰椎负载能力，增加退变性腰椎疾病的易感性。

本组男女比例为1:5；女性患者比例明显偏高，提示女性是腰椎滑脱症椎间盘真空征的高发人群，其GDF5基因多态性可能与男性存在明显差异化，为此，本研究进一步分析不同性别之间GDF5 rs143383基因多态性，结果发现女性基因频率分布、等位基因频率与男性存在显著差异，其中显性模型和隐性模型均有明显统计学差异，提示携带T等位基因的退变性腰椎滑脱症女性患者是椎间盘真空征的易感人群。Williams 等[26]对北欧退变性腰椎间盘疾病患者进行GDF5基因re143383位点基因多态性研究，发现携带+104T/C女性是退变性腰椎间盘疾病的易感人群。分析其原因，与雌激素的促骨形成作用有关。相关研究发现，雌激素可促进转化生长因子-β(transforming growth factor - β,TGF-β)家族成员-骨形态发生蛋白2 (Bone morphogenetic protein 2,BMP2 ) 基因转录，促进骨形成[27]。GDF5作为骨形态发生蛋白、TGF-β家族成员之一，其结构和功能与BMP2类似，因此GDF5基因表达可能与雌激素水平存在相关性，导致了性别在GDF5 基因多态性在椎间盘真空征相关性方面的差异化出现。本研究Logisitic回归分析结果显示，GDF5基因多态性与椎间盘真空征的发生独立相关，通过进一步校正混杂因素，发现携带TT基因型个体发生椎间盘真空征的风险较高，提示T等位基因可能增加退变性腰椎滑脱患者椎间盘真空征的发生风险。

综上所述，本研究结果显示携带GDF5 rs143383位点TT基因型的退变性腰椎滑脱症患者发生椎间盘真空征易感性明显增加，且该现象在女性患者中更为突出。本研究创新之处在于阐述了GDF5基因多态性与椎间盘真空征发生的关联，这在以往研究少见；局限之处在于，椎间盘真空征见于多种退变性疾病，本研究仅以退变性腰椎滑脱患者为样本，存在一定的局限性。上述局限均有待于在以后研究中扩大样本数量，增加疾病种类，以探索不同脊椎疾病椎间盘真空征的遗传学特征。