一株具有广谱抗真菌活性的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定

刘小玉，付登强，刘立云，黄丽云，齐 兰

（1.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌 571339；2.海南省槟榔产业工程研究中心，海南文昌 571339）

近年来，化肥的施用显著提高了作物产量，但为追求高产，盲目、过量施用化肥，造成了土壤肥力的严重流失，也导致部分地区植物土传病害日益加重[1]。植物病虫害防治过程中化学药剂的大量使用会带来环境污染、农药残留、植物病原菌产生抗药性等诸多副作用，而生物防治可弥补化学防治的不足，逐渐成为病虫害防治的发展趋势[2-4]。

解淀粉芽孢杆菌具有广泛抗菌能力，属革兰氏阳性菌，是目前研究较热门的一类植物根际促生防病细菌。有研究表明，解淀粉芽孢杆菌通过产生植物生长激素IAA，分泌葡聚糖酶、几丁质酶以及脂肽类抗菌活性物质，从而抑制植物病原菌，预防植物病害[5]。本文从油茶枯饼发酵液中分离筛选获得菌株ck-05，通过平板对峙试验研究了其对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌、槟榔炭疽病菌、槟榔心腐病菌等11种植物病原菌的拮抗作用，并通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术等方法对菌株ck-05进行了鉴定，研究了其生物学特性，旨在为该菌株的推广和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

油茶枯饼：中国热带农业科学院椰子研究所提供。

油茶枯饼∶水=1∶10（g/g）制成混合液，然后45 ℃发酵培养24 h制备茶枯发酵液，方法参考专利的方法[6]。

1.2 培养基

LB培养基：酵母粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，琼脂18～20 g，水1 L，pH7.0～7.2。

PDA培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g,琼脂18～20 g，水1 L。

1.3 供试病原菌

槟榔炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、槟榔心腐病菌（Fusarium oxysporum）、椰子茎腐病菌（Ceratocystis paradoxa）、菜心炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）、油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、油棕心腐病菌（Fusarium oxysporum）、椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis pal marum）、板栗疫病菌（Cryphonectria para sitica）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense4）、油茶叶斑病菌（Lasiodiplodia theobromae）、花生果腐病菌（Fusarium oxysporum），均由中国热带农业科学院椰子研究所实验室提供。

1.4 方法

1.4.1 菌株ck-05的分离与纯化

称取10 g油茶饼粕发酵液，加入90 mL无菌水中，200 r/min震荡培养30 min，摇匀后的样品用无菌水稀释10-1、10-2、10-3倍，分别取0.1 mL涂布于LB培养基上，45℃恒温培养箱中培养48 h。挑取不同形态特征的单菌落进行分离与纯化，将得到的纯化菌株转移至新的LB平板上，2 d后观察菌落形态特征。将纯培养的菌株转入LB斜面，置于冰箱中保存备用。

1.4.2 拮抗活性的测定

采用平板对峙法[7]进行拮抗活性测定。直径为5 mm的各病原菌菌饼分别接种在PDA平板中心，并将待测拮抗菌接种在距离中心25 mm的成正方形的4个点处，置于培养箱中28 ℃培养，以不接拮抗菌的PDA平板为对照，各处理设3次重复，待对照组病原菌长满平板后，观察并测量试验组抑菌带直径，抑菌带直径越大，抑菌活性越强。

1.4.3 菌株ck-05形态学观察及生理生化特性鉴定

将菌株ck-05接种在LB平板上，37 ℃培养2 d。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[8]对菌株的形状、颜色、透明度等菌落形态特征及接触酶试验、甲基红、V-P、硝酸盐还原、淀粉水解、氧化酶、明胶液化等主要生理生化特征的试验和观察记录。

1.4.4 菌株的分子学鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取目的菌株的DNA作为模板，通用引物27 F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。取50 mL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在紫外灯下观察，并拍照保存。将PCR产物送至华大基因科技股份有限公司进行测序，并将序列通过在NCBI网站上进行Blast对比，采用BioEdit、Mega5.0等软件对菌株进行系统发育分析[9]。

1.4.5 菌株ck-05的生物学特性研究

（1）制备种子培养液

将菌株ck-05接种至LB液体培养基中，在30 ℃、200 r/min摇床中震荡培养48 h，用无菌水将浓度调至1×108cfu/L，即为种子培养液[9-10]。

（2）pH值对菌株ck-05生长的影响

配制LB液体培养基，用稀HCl和稀NaOH调节LB液体培养基的pH值，pH设为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8个梯度。分别将1 mL菌株ck-05种子培养液接种于50 mL不同pH的LB液体培养基中，于30 ℃、200 r/min摇床中震荡培养48 h后测OD600值。每个处理设3次重复，以等量无菌水的LB液体培养基为对照[8-9]。

（3）NaCl浓度对菌株ck-05生长的影响

基础培养基为LB液体培养基，其中NaCl浓度分别设置成0、5、10、15、20、25 g/L等6个梯度。将1 mL菌株ck-05种子培养液分别接种至不同NaCl浓度的液体培养基中，于30 ℃、200 r/min摇床中震荡培养48 h后测OD600值。每个处理设3次重复，以等量无菌水的LB液体培养基为对照[9-10]。

（4）菌株ck-05最适生长温度的测定

将1 mL菌株ck-05种子培养液接种于50 mL、pH为7.0的LB液体培养基中，分别于10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃，200 r/min摇床中震荡培养，48 h后测OD600值。每个处理设3次重复，以等量无菌水的LB液体培养基为对照[10-11]。

1.5 数据处理

数据处理及绘图采用WPS表格，数据统计分析采用SAS软件。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

45 ℃培养48 h后，获得1株具有抑菌作用的菌株ck-05，且抑菌谱广，抑菌活性强。

2.2 菌株ck-05抑菌谱的测定

菌株ck-05对11种病原菌的抑制作用见表1。由表可以看出，菌株ck-05对11株植物病原菌均有抑制效果，对不同病原菌的抑制效果差异显著，其中对香蕉枯萎病菌的抑制作用最强，抑菌带直径为22.0 mm，其次为花生果腐病菌和椰子茎腐病菌，抑菌带直径均为19.3 mm，对板栗疫病菌的抑制作用最差，抑菌带直径只有7.7 mm。由此可见，菌株ck-05抗菌范围较广。

表1 菌株ck-05对11种病原菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of strain ck-05 on 11 kinds of pathogenic bacteria

2.3 菌株ck-05的鉴定

2.3.1 菌株的形态学鉴定

图1 菌株ck-05在LB平板上培养3 d的形态Fig.1 Morphology of strain ck-05 cultured on LB medium for 3 d

菌株ck-05在LB平板上30 ℃培养48 h后，菌落为圆形，小而突起，边缘较整齐，稍透明，白色（见图1）。在光学显微镜下观察为短杆状，革兰氏染色为阳性，芽孢为椭圆形（见图2）。

图2 菌株ck-05的显微形态Fig.2 Micromorphology of strain ck-05

2.3.2 菌株的生理生化鉴定

对菌株ck-05进行部分生理生化试验，常规生理生化试验结果（表2）表明，菌株ck-05的生理生化特征与《常见细菌系统鉴定手册》中有关芽孢杆菌种属鉴别特征基本一致，初步推测菌株ck-05为芽孢杆菌属。

表2 菌株ck-05主要生理生化特征Table 2 The main physiological and biochemical characteristic of strain ck-05

2.3.3 菌株的分子学鉴定

菌株ck-05的16S rDNA经序列测定得到1 435 bp的基因片段。根据序列同源性从高到低的原则，挑取14株菌株的16S rDNA序列构建系统发育树（图3），结果显示菌株ck-05与B.amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）相似度达100%，结合形态特征和生理生化特征，鉴定菌株ck-05为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens，登录号：MK592621）。

图3 菌株ck-05系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of strain ck-05

2.4 菌株ck-05的生长环境分析

2.4.1 pH值对菌株ck-05生长的影响

pH值对菌株ck-05生长的影响见图4。由图可知，pH对菌株ck-05生长的影响明显。其中，pH在4.0～9.0范围内菌株ck-05均能生长，在pH为10.0、11.0的条件下菌株ck-05几乎不生长，其中pH7.0是菌株ck-05的最适宜pH，其OD600值为1.742。

图4 pH对菌株ck-05生长的影响Fig.4 Effect of pH on the growth of strain ck-05

2.4.2 NaCl浓度对菌株ck-05生长的影响

由图5可以看出，随着NaCl浓度的增加，OD600值先增大后减少，当NaCl浓度为5 g/L时，菌株ck-05生长最好，OD600值最大，为1.233；在NaCl浓度为5～25 g/L时，随着NaCl浓度的增加，菌株ck-05的生长逐渐被抑制。

图5 NaCl对菌株ck-05生长的影响Fig.5 Effect of NaCl on the growth of strain ck-05

2.4.3 温度对菌株ck-05的影响

温度对菌株ck-05生长的影响见图6。由图可以看出，温度对菌株ck-05生长的影响明显，在30～45 ℃温度范围内，菌株均能生长很好；但在20 ℃以下、50 ℃以上时，菌株几乎不生长。

图6 温度对菌株ck-05生长的影响Fig.6 Effect of temperature on the growth of strain ck-05

3 结论与讨论

由于解淀粉芽孢杆菌能够分泌多种抑菌物质，具有诱导作物产生抗性能力等优点，近年来其已成为研究生物防治的热门菌种之一。如李杨等[12]研究发现解淀粉芽孢杆菌ZJ01对苹果轮纹病菌有较强的抑制作用。权春善等[13]、王军华等[14]研究发现解淀粉芽孢杆菌Q-12发酵液对病原菌菌丝细胞有强烈的破坏作用，能抑制病原菌菌丝的生长速度。王晓辉等[14]研究认为解淀粉芽孢杆菌K1发酵液可有效抑制灰霉病菌的生长。Arrebola等[15]的研究发现解淀粉芽孢杆菌PPCB004对青霉属真菌的菌丝延伸有强烈的抑制作用，其中对壳青霉菌的抑制作用最强，抑菌率达73.3%。本研究筛选的菌株ck-05对供试的11种植物病原菌均具有较强的抑制作用，其中对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌的抑制性最强，抑菌带直径为22.0mm，对槟榔炭疽病菌、槟榔心腐病菌的抑菌带直径分别为16.3 mm、14.7 mm，对板栗疫病菌的抑制效果最差，抑菌带直径只有7.7 mm。由此可知，菌株ck-05具有广谱抑菌活性。结合形态学观察、生理生化试验及分子生物学技术等方法，菌株ck-05被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。另外，生物学特性研究结果表明，菌株ck-05最适生长温度30～45 ℃，20 ℃以下、50 ℃以上几乎不生长；pH为7.0时，生长最佳；在NaCl浓度为5 g/L时，生长情况最好。

菌株ck-05具有广谱抑菌活性，可将其开发为生防菌，研究成生物农药，但将其开发成生防菌也有很多问题需要考虑：一是生产成本问题，生防菌与化学农药相比分泌量较低，生产周期长，这些因素会相应增加生产成本；二是田间应用问题。一方面定殖能力有待深入研究，另一方面，田间复杂的微生物环境、温度、pH等因素会影响生防菌的实际抑菌效果。然而，随着科学技术的提高，这些问题会得到解决，将解淀粉芽孢杆菌开发成生物农药会被广泛地应用，本研究可为菌株ck-05的开发应用奠定理论基础。