响应面法优化百合蜂蜜复合醋醋酸发酵工艺条件

徐贵静，王新本，贾孝荣

（兰州古驰生物科技有限公司，甘肃兰州 730050）

百合（Lilium browniivar.viridulum Baker）是百合科百合属多年生草本球根植物，又名强蜀、山丹、中逢花、百合蒜等[1-2]。百合不仅含有丰富的营养成分，还具有多种功能性成分，如总磷脂、多糖、粗纤维、酚类等[3-5]，是国家卫计委公布的首批药食同源植物之一。研究表明，百合具有抗癌、抗氧化、抗过敏、调节免疫、降血糖、止咳平喘等保健功能[6-8]。而蜂蜜含有大量的糖类、维生素、矿物质和氨基酸[9-10]，其单糖可被人体直接吸收，对妇女、幼儿，特别是老人具有良好的保健作用。研究表明，蜂蜜可改善血液成分，促进心脑血管功能；促使肝细胞再生，抑制脂肪肝的形成；增强抵抗力，促进睡眠和胃肠蠕动等[11-12]。

传统食醋是以高粱、大米等富含淀粉的作物为原料，在微生物作用下，经酒精发酵、醋酸发酵及后熟、陈酿等工艺酿造而成的一种酸性调味品。除了含有大量的醋酸外，醋还含有钙、铁、乳酸、甘油及脂肪酸等物质，研究表明经常食用醋可促进脂肪和糖类物质的代谢，利尿通便，还可降低血压和血清胆固醇[13]。但是随着生活水平的提高，人们对醋的需求不再局限于传统风味，而是有了更多特色风味的需求[14-16]。目前百合类醋只有百合与苦荞、南瓜及杜仲发酵酿造的醋[17-19]，尚未见百合与蜂蜜共同发酵酿造醋的研究。因此本研究以鲜百合、蜂蜜为原料，应用响应面法优化了百合蜂蜜复合醋醋酸发酵工艺参数，为百合蜂蜜复合醋的生产提供理论支持和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

兰州百合，2019年11月采摘，兰州市售。

醋酸菌C1，实验室分离；蜂蜜，市售；食品级α-淀粉酶（2 000 U/g），邢台万达生物工程有限公司；食品级糖化酶（50 000 U/g），江苏博立生物制品有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800PC紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GL-21M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Mettler Toledo AL204分析天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；摇床，中科院武汉科学仪器厂；离心机，上海医用分析仪器厂；恒温水浴箱，北京医疗设备厂；磁力搅拌器，上海南汇电讯器材厂。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

百合预处理→混合蜂蜜→配料→灭菌→接种→酒精发酵→醋酸发酵→灭菌→陈酿→澄清→灌装→成品

1.3.2 操作要点

（1）百合预处理

鲜百合清洗去除泥沙等杂物，并去除腐烂、褐变的百合，打浆后待用（打浆时加入1‰抗坏血酸，防止褐变）。由于鲜百合含有大量的淀粉，容易产生沉淀且会影响饮料的口感，因此，必须将之降解，本试验选用反应条件较为温和的生物酶降解工艺，尽可能地保留百合原有的营养成分及自然风味[20]。采用先液化后糖化的工艺，液化温度70～88 ℃，α-淀粉酶添加量为12 U/g；糖化温度58～62 ℃，糖化酶添加量为200 U/g。

（2）酒精发酵

将蜂蜜、百合处理液及水按照一定的比例混合，加入活化后的酵母（添加量1%），发酵温度为28～38 ℃，发酵一段时间后得到发酵底液；酒精发酵初期酵母菌大量繁殖，需要通入少量空气，中后期进行酒精发酵，为无氧发酵，并在发酵过程中控制发酵温度及排除所产生的CO2气体[21-22]。

（3）醋酸发酵及陈酿

酒精发酵结束后，将醋酸菌种扩大培养液接入酒精发酵醪中发酵，发酵温度28～38 ℃，发酵一段时间后灭菌，于4～10 ℃条件下陈酿30 d[23-25]。

（4）澄清

加入1‰皂土于4 ℃澄清12 h，上清液进行灭菌。皂土在使用前必须活化，活化方法为皂土与水按照质量比1∶10混匀，混匀后静置24～48 h[26-27]。

1.3.3 百合和蜂蜜配比的确定

将百合和蜂蜜分别按照比例2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4添加，按照1.3.1的工艺流程酿造百合蜂蜜复合醋，以感官评分（外观20%、香气20%、口味40%和风格20%）作为评价指标，由25名专业人士对百合蜂蜜醋的感观进行评价。

1.3.4 百合蜂蜜复合醋醋酸发酵工艺单因素试验

分别考察初始酒精度、接种量、发酵温度及发酵时间4个因素对百合蜂蜜复合醋酸度的影响，初始酒精度设置为4°、6°、8°、10°、12°；接种量设置为3%、4%、5%、6%、7%；发酵温度设置为28、30、32、34、36 ℃；发酵时间为4、6、8、10、12 d。

1.3.5 百合蜂蜜复合醋发酵工艺优化

为了更好地确定百合蜂蜜复合醋的最佳工艺参数，运用BOX-Behnken的中心组合设计试验，选取初始酒精度（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个重要工艺参数为因素，以发酵结束后醋的酸度为评价指标，优化百合蜂蜜复合醋醋酸发酵工艺条件，响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 BOX-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of BOX-Behnken experiments design

1.4 酸度的测定方法

酸度的测定参照GB 2719—2018的方法。

1.5 数据分析

采用SPSS 21.0软件进行均差等数据的分析，采用Office 2010软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 百合和蜂蜜配比的确定

图1显示了百合和蜂蜜的添加配比，由图1可知，当百合和蜂蜜配比为1∶3时，百合蜂蜜复合醋的感官评分最高，因此，百合和蜂蜜配比确定为1∶3。

图1 百合和蜂蜜添加配比的确定Fig.1 Determination of additive ratio of Lilium and honey

2.2 单因素试验结果

2.2.1 初始酒精度对百合蜂蜜复合醋酸度的影响

不同初始酒精度对百合蜂蜜复合醋酸度的影响结果见图2。由图2可知，随着初始酒精度的升高，酸度呈现先升后降的趋势，当初始酒精度为8°时，酸度最高，可达4.11%。分析认为初始酒精度低，醋酸菌转化产生的醋酸含量低，而酒精度偏高则抑制了醋酸菌的生长，导致所产百合蜂蜜复合醋的酸度降低。因此，选择初始酒精度为8°进行后续的响应面试验。

图2 初始酒精度对百合蜂蜜复合醋酸度的影响Fig.2 Effect of different alcohol of Lilium and honey compound vinegar

2.2.2 接种量对百合蜂蜜复合醋酸度的影响

不同接种量对百合蜂蜜复合醋酸度的影响见图3。由图可知，随着接种量的升高，其酸度呈现先增后减的趋势。适当增加醋酸菌接种量会缩短发酵周期，但是接种量过大会消耗发酵液中的酒精，同时产生过多的代谢产物，导致其细胞老化、自溶等，从而影响复合醋的产量。当接种量为6%时，复合醋的酸度最高。因此，接种量选择6%进行后续的响应面试验。

图3 接种量对百合蜂蜜复合醋酸度的影响Fig.3 Effect of different inoculum size of Lilium and honey compound vinegar

2.2.3 发酵温度对百合蜂蜜复合醋酸度的影响

发酵温度对百合蜂蜜复合醋酸度的影响见图4（见下页）。由图可知，随着发酵温度的增加，百合蜂蜜复合醋的酸度呈现先增加后降低的趋势，发酵温度为34 ℃时，酸度最高。发酵温度过低，不利于醋酸菌的生长，而温度过高，则会导致部分乙酸被氧化，加快醋酸菌的老化，造成百合蜂蜜复合醋的酸度低。因此选择发酵温度为34 ℃进行后续的响应面试验。

图4 发酵温度对百合蜂蜜复合醋酸度的影响Fig.4 Effect of different fermentation temperature of Lilium and honey compound vinegar

2.2.4 发酵时间对百合蜂蜜复合醋酸度的影响

发酵时间对百合蜂蜜复合醋酸度的影响见图5。由图5可知，随着醋酸发酵时间的增加，其酸度呈现先增后减的趋势，当发酵10 d时，复合醋的感观评分最高。随着发酵的进行酸度逐渐增加，但由于过度发酵会导致部分乙酸被氧化。因此，选择发酵时间为10 d进行后续的响应面试验。

图5 发酵时间对百合蜂蜜复合醋酸度的影响Fig.5 Effect of different fermentation time of Lilium and honey compound vinegar

2.3 响应面试验结果及模型的建立

本研究根据百合蜂蜜复合醋的发酵工艺单因素试验结果，最后选定初始酒精度、接种量、发酵温度及发酵时间为优化试验的四个因素，以酸度为响应值，利用Design-Expert 8.0.5b软件进行4因素3水平Box-Behnken试验设计，各因素水平见表1，试验结果见表2，其二次多元回归模型为：R=5.32+0.072A+0.053B+0.38C+0.12D+0.013AB-0.020AC+0.032AD-0.052BC+0.020BD-5.000×10-3CD-0.45A2-0.49B2-0.77C2-0.69D2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 The result and condition of response surface experiment

由回归模型的方差分析（表3）可以看出：模型差异极显著（P＜0.000 1），失拟项差异不显著（P=0.054 0＞0.05），决定系数（R2）为0.984 4，校正系数（AdjR2）为0.968 9，该模型可以涵盖该模型91.49%响应值的变化，因而拟合程度良好，试验误差小；且该回归模型一次项、二次项及交互项中的A、C、D、BC、A2、B2、C2、D2均表现出显著水平；各因素对产品酸度的影响依次为发酵温度＞发酵时间＞初始酒精度＞接种量。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

图6 初始酒精度、接种量、发酵温度及发酵时间的交互作用对百合蜂蜜复合醋的影响Fig.6 Interaction of alcohol,inoculum size,fermentation temperature and fermentation time on Lilium and honey compound vinegar

初始酒精度（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）间的交互作用对产品总酸的影响如图6所示。由图可知，当初始酒精度一定时，随着接种量的增大，百合蜂蜜复合醋的酸度呈现先增后减的趋势。当接种量恒定时，随着初始酒精度的增大，复合醋酸度呈现先增后减的趋势，其它两因素间的交互作用也均呈现先增大后缓慢降低的趋势。

2.4 响应面工艺的验证

通过响应面设计优化试验分析，得出百合蜂蜜复合醋的最佳工艺条件为初始酒精度8.16°，接种量6.04%，发酵温度34.5 ℃，发酵时间10.09 d，在此条件下预测发酵得到的百合蜂蜜复合醋酸度为5.38%。结合实际生产，将其修正为初始酒精度8.2°，接种量6%，发酵温度34.5 ℃，发酵时间10 d，在此条件下进行验证试验，得到百合蜂蜜复合醋的酸度为5.42%，与预测值之间的相对误差为0.74%，其参数具有一定的实用价值。

3 小结

对百合蜂蜜复合醋的发酵工艺进行响应面优化，确定了最佳工艺条件为初始酒精度8.2°，接种量6%，发酵温度34.5 ℃，发酵时间10 d，在此条件下百合蜂蜜醋的酸度为5.42%，与预测值之间的相对误差为0.74%。各因素对百合蜂蜜复合醋的影响大小依次为发酵温度＞发酵时间＞初始酒精度＞接种量。通过对回归模型的可靠性分析，得知该回归模型极显著，拟合度较好。因此，本试验得到的参数具有一定的实用价值，所酿制的百合蜂蜜复合醋呈淡琥珀色，无沉淀物，酸味柔和，有醋香味及百合和蜂蜜的风味。