混配精油纳米乳液制备及其对大蜡螟生物活性

刘琪，毛敏敏，阮永明

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321000)

大蜡螟是蜂群的主要害虫之一，是一种极具破坏性的昆虫，会攻击和破坏蜂巢。其幼虫不仅取食蜂蜡，还会在蜂巢内留下大量隧道，这给养蜂业造成严重伤害[1]。由于蜜蜂对粮食生产有巨大贡献，大蜡螟对其造成的伤害已给全球粮食和营养安全构成威胁，已引起广泛关注与担忧[2-3]。而作为一种低毒、易降解、具有选择性等多种优势的天然杀虫剂，植物精油受到广泛关注[4]。

植物精油是一类广泛存在于植物体内、易于挥发、具有芳香气味的油状液体的总称，有的种类具有杀虫灭菌的效果。但由于植物精油易于挥发，且对温度、光照及空气的影响极为敏感，极易分解变质[5]，致使其杀虫效果不稳定，利用率降低，经济投入较高，极大影响了植物精油杀虫剂的田间推广应用，纳米精油杀虫剂的出现可改善这种状况。

微米乳液也被称为纳米乳液或细乳液，纳米乳剂是微细的水包油分散体，其液滴尺寸为10～200 nm[6]。乳化液是一个热力学不稳定的两相体系，由至少2种不相溶的液体和乳化剂组成，其中一种液体以小液滴的形式分散在另一种液体中[7]。纳米乳是亚稳态体系，其稳定性取决于合成或制备的方法[8]，制备方法有高能乳化和低能乳化2种。

研究表明，精油是通过吸入、摄入或皮肤吸收进入昆虫体内的，精油可能会干扰昆虫的生理和神经系统[9-10]。乙酰胆碱酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是昆虫体内重要的解毒酶，其活性会因为外源物质的侵入而发生变化(抑制或增强)，是反映该外源物对害虫控制效果的指标之一[11-13]。

本文选择更为稳定的精油纳米配方，对比纳米乳液和粗乳液生物活性的强弱，测定纳米乳剂对AchE、CarE和GST活力的影响，探讨其作用模式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫

供试大蜡螟取自浙江省金华市农科院蜜蜂所。在人工气候箱(RXZ智能型，宁波市科技园区新江南仪器有限公司)内培养，在(30±1)℃温度、相对湿度50%～60%的全暗条件下进行室内人工饲养，取3龄大蜡螟幼虫进行试验。

1.1.2 供试试剂

α-松油烯(纯度99%)、γ-松油烯(纯度99%)、异松油烯(纯度99%)、松油烯-4-醇(纯度99%)、1,8-桉叶素(纯度99%)均购自云南森美达生物科技有限公司；吐温80(纯度100%)购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度试剂盒、AchE活性检测试剂盒、CarE活性检测试剂盒、GST活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 纳米乳液制备

水包油精油纳米乳液由混配精油(α-松油烯、γ-松油烯、异松油烯、松油烯-4-醇、1,8-桉叶素体积比为25∶45.5∶20∶5∶4.5)、表面活性剂吐温80和水组成。首先，将混配精油与表面活性剂吐温80以体积比为1∶1(F1)、1∶2(F2)、1∶3(F3)混合，加入水得到3种配方，使用混匀仪混匀得到粗乳液；使用高速搅拌器以1 000 rmp速度持续搅拌60 min，以确保精油粒子以纳米乳的形式稳定而精细地分散在乳液中。

1.2.2 乳液液滴测量

用纳米粒度Zeta电位分析仪测定精油纳米乳液配方、精油粗乳液的液滴粒径大小及多分散性指数(PDI)。PDI是纳米乳液体系中液滴粒径均匀性和稳定性的量度。PDI<0.3表明纳米乳液的粒径分布较窄，可为所制备的纳米乳液提供长期稳定性。

1.2.3 精油纳米乳液和精油粗乳液触杀活性

选择稳定性强的配方作为触杀活性测量药剂，采用不同处理剂量的精油纳米乳液和精油粗乳液进行触杀处理，每组20头，重复3次。以纯水为对照组，24 h后统计死亡率，求毒力回归方程。

1.2.4 酶活性测量

设5个混配精油浓度，T1～T5分别为12.89、25.77、51.54、103.08、206.16 μg·larva-1，对大蜡螟幼虫进行触杀处理，CK为空白对照组，24 h后测定其体内AchE、CarE、GST的活性变化。酶活性按照样本蛋白浓度计算。

2 结果与分析

2.1 液滴大小

对3种配方进行混匀搅拌和高速搅拌，形成粗乳液和纳米乳液，测定其液滴粒径大小。在高速搅拌乳化过程中，通过能量输入来增强纳米乳液的稳定性，吐温80的浓度在其中发挥了重要作用。由表1可知，3种配方经过普通混匀和高速搅拌后，高速搅拌的纳米乳液外观比粗乳液更为均匀澄澈。热力学稳定循环后发现，F3纳米乳液没有分离阶段，尽管如此，最好还是选择新配制的纳米乳液备用；F3由于其液滴最小且粒径分布均匀而被选择进一步应用研究。

表1 搅拌方式对粒径大小的影响

2.2 F3纳米乳液与粗乳液触杀活性

由表2可知，F3的纳米乳液和粗乳液对大蜡螟均有一定触杀作用，对大蜡螟触杀毒力的半数致死剂量(LD50)分别为28.991、514.056 μg·larva-1，说明精油纳米乳液的触杀活性极显著强于精油粗乳液，可见精油纳米乳液具有进一步开发为杀虫剂的潜能。

表2 不同乳液对大蜡螟幼虫触杀毒力

2.3 AchE活性测定

由图1可知，受精油纳米乳液的影响，大蜡螟体内AchE活力被抑制，且随着精油纳米乳液处理剂量的增加，抑制作用整体呈增加趋势；T2处理的大蜡螟体内AchE活力回升，且与其相邻处理浓度对比差异显著，表明大蜡螟体内AchE活力在受到精油纳米乳液胁迫后，表现为先被抑制后被激活的特性。T3～T5处理的大蜡螟体内AchE活力显著低于对照组，且组间差异显著。在206.16 μg·larva-1最大处理剂量下，精油纳米乳液对大蜡螟体内AchE酶活力的抑制率最高，达48.81%。

柱间无相同小写字母表示组间差异显著(图2～3同)。

2.4 CarE活性测定

由图2可知，受到精油纳米乳液的影响，大蜡螟体内CarE活力被抑制，随着精油纳米乳液处理剂量的增加，抑制作用整体呈增加趋势。T1处理的大蜡螟体内CarE活力呈激活状态；T2处理有所下降，与其相邻组对比差异显著，表明大蜡螟体内CarE活力受到精油纳米乳液的胁迫，表现为先被激活后被抑制。之后随着处理剂量的增加，大蜡螟体内CarE活力逐步降低，且显著低于对照组。在206.16 μg·larva-1最大处理剂量下，精油纳米乳液对大蜡螟体内CarE活力的抑制率达41.92%。

图2 不同剂量精油纳米乳液处理对大蜡螟体内CarE活力的影响

2.5 GST活性测定

由图3可知，随着精油纳米乳液处理剂量的增加，大蜡螟体内GST活力有所变化。T1处理的大蜡螟体内GST活力受到抑制；T2～T4处理的GST活力被激活；T5处理GST活力受到抑制，精油纳米乳液对GST活力的抑制率为19.97%。由此可知，大蜡螟体内GST活力随着精油纳米乳液剂量的增加，无明显的变化规律。

图3 不同剂量精油纳米乳液处理对大蜡螟体内GST活力的影响

3 讨论

纳米乳液不仅在动力学上稳定，且物理性质也稳定，在较长一段时间内都没有明显的絮凝或聚结[14]。本试验表明，高速搅拌乳化形成的纳米乳液液滴直径小、分布均匀。在纳米乳液的液滴大小中，表面活性剂在乳液中的浓度也发挥了重要作用，纳米乳液粒径的大小随着乳液中吐温80浓度的增加而减小。在纳米乳液形成过程中，吉布斯自由能大于零，这是热力学不稳定的系统，表面活性剂作为乳化剂，通过降低纳米乳液制备所需的自由能量，降低油/水界面的张力，因此，可通过调节乳液中表面活性剂的浓度来得到更为稳定的纳米乳液[15]。

本文中测得的纳米乳液和粗乳液对大蜡螟的LD50分别为28.991、514.056 μg·larva-1，可见杀死同样数量的大蜡螟，纳米乳液的精油浓度更低。由此表明，纳米乳液可显著降低所需的精油浓度，并且挥发精油的接触毒性和持久性更高。

精油纳米乳液对大蜡螟体内乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶活力具有显著的抑制作用，随着处理剂量的增加，抑制作用整体呈现增加的趋势。在最大处理剂量206.16 μg·larva-1下，精油纳米乳液对大蜡螟体内AchE、CarE活力的抑制率分别为48.81%、41.92%，相比对照差异显著；而GST活力与剂量的增加无明显的变化规律，且组间差异不显著。所以推测AchE、CarE是精油纳米乳液的作用靶标，对GST活性的影响不是引起中毒的原因。因昆虫体内对外源物质反应机制复杂多样，所以精油纳米乳液对害虫的作用机制还需进一步探究。