玉米钙依赖蛋白激酶38(ZmCDPK38)的生物信息学及表达特性分析

李建平，足木热木·吐尔逊，常晓春，郝晓燕，陈 果，高升旗，孙良斌，黄全生

(新疆农业科学院核技术生物技术研究所/新疆农作物生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】玉米等高等植物在长期的进化过程中形成一系列生理或发育机制来响应环境中的各种胁迫[1]。这些生理或发育机制在生化水平上涉及许多重要的生化代谢途径的调节；在分子水平上涉及包括逆境胁迫信号的传递与基因转录控制等一系列过程[2]。但是，植物应对逆境胁迫的调控机制是异常复杂的[3]。利用分子生物学方法和手段探索作物的耐旱机制，改善作物本身的抗旱能力，进而发现新的遗传资源成为培育耐旱新品种的重要环节。【前人研究进展】1982年Hetherington等首次在豌豆(Pisumsativum)中发现1个CDPKs[4]。随后在植物、原生动物中相继发现了CDPKs的存在[5]。在拟南芥(Arabidopisthaliana)中目前已发现34个CDPKs[6]，水稻中有31个成员[7]，玉米(Zeamays)中有40个CDPKs[8]。除此之外，在其它植物中，例如：马铃薯[9](Solanum)、番茄[10](Lycopersiconesculuentum)、小麦[11](Triticumaestivum)和棉花[12](Gossypiumraimondii)中也相继发现了CDPKs家族。在玉米中，目前已发现40个玉米钙依赖蛋白激酶(ZmCDPK)，其中ZmCDPK1、ZmCDPK7、ZmCDPK9、ZmCDPK10、ZmCDPK11、ZmCDPK22、ZmCDPK28和ZmCDPK34等基因相继被克隆，并且研究发现这些CDPKs基因在接收盐、ABA和H2O2等胁迫信号后转录水平上调[13]。玉米CDPK基因可能参与玉米生物非生物胁迫信号途径，但是其功能及信号传导机制目前尚不清晰，还有待深入研究。【本研究切入点】部分ZmCDPK基因成员如ZmCDPK38目前尚未见相关研究报道，是否响应非生物胁迫及其在非生物胁迫中发挥什么样的功能有待发掘和研究。【拟解决的关键问题】研究以ZmCDPK38作为研究对象，从生物信息学角度和基因表达特性2个方面对该基因的功能进行判断，为研究该基因的功能提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

玉米自交系B73种子由中国农科院作物科学研究所王国英课题组提供。

Trizol总RNA提取试剂购自Invitrogene公司；第一链cDNA合成试剂盒购自全式金生物科技有限公司。Real-time PCR试剂盒购置ABI公司，其它普通化学试剂均为国产。

1.2 方 法

1.2.1 ZmCDPK38的序列比对及聚类遗传分析

ZmCDPK38的氨基酸序列多重比对分析通过在线软件Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)进行。系统进化分析基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库与MEGAX软件的ClustalW功能，采用NJ算法构建的系统进化树，Boot Strap参数设为500，其他参数设为默认值。

1.2.2 ZmCDPK38氨基酸结构域及Motif保守序列

ZmCDPK38氨基酸结构域分析基于NCBI蛋白结构CCD在线工具进行。利用MEME(http://meme-suite.org/)在线软件分析玉米CDPK家族结构域保守序列。

1.2.3 基因表达

1.2.3.1ZmCDPK38基因在玉米不同组织中的表达分析：分别提取玉米的根、茎、叶、雄穗和雌穗的总RNA并反转录合成cDNA。

1.2.3.2ZmCDPK38基因在不同非生物胁迫条件下的表达分析：花盆中16 h光照/8 h黑暗下生长的玉米幼苗待长至三叶期时进行胁迫处理：(1)温度胁迫：幼苗分别移至4和42℃处理，正常条件下生长的幼苗作为对照，在不同处理时间段整株采样，每次取样5株，生物学重复3次；(2)盐胁迫：三叶期幼苗从花盆中取出，洗去根部残留培养基质并尽量避免伤根，将幼苗于Hoagland营养液中水培3 d后移至含250 mM NaCl的Hoagland营养液中培养，于不同时间段取样，每次取样5株，生物学重复3次；(3)干旱处理：三叶期幼苗从花盆中取出，洗去根部残留培养基质并尽量避免伤根，将幼苗于Hoagland营养液中水培3 d后移至含10%PEG6000的Hoagland营养液中培养，于不同时间段取样，每次取样5株，生物学重复3次。所有样品经提取总RNA及反转录后，通过实时荧光定量PCR分析在不同非生物胁迫条件下ZmCDPK38基因的表达情况。

2 结果与分析

2.1 ZmCDPK38的蛋白序列比对及遗传进化

研究表明，玉米ZmCDPK38基因编码区长度为1 719 bp，编码512个氨基酸。该氨基酸序列在NCBI进行blast后发现拟南芥CDPK28(AtCDPK28)、拟南芥CDPK18(AtCDPK18)、大豆CDPK28(GmCDPK28)、玉米CDPK28(ZmCDPK28)、高粱CDPK18(SbCDPK18)、辣椒CDPK16(CbCDPK16)及烟草CDPK28 (NtCDPK28)与其序列同源性较高，ZmCDPK38与其它7个CDPK的序列相对较为保守，均具有典型的蛋白激酶区域。蛋白激酶活性调控区域由20～30个氨基酸残基组成，富含碱性氨基酸。遗传进化及序列一致性分析结果显示，ZmCDPK38除了与ZmCDPK28亲缘关系较近，序列一致性高达90.43%，与高粱SbCDPK18的亲缘关系同样较近，序列一致性为87.28%。与其它物种的CDPK氨基酸序列一致性依次为GmCDPK28(82.30%)、AtCDPK18(80.84%)、CbCDPK16(79.68%)、AtCDPK28(78.83%)及NtCDPK28(73.23%)。图1，图2

2.2 ZmCDPK38的蛋白结构域

研究表明，ZmCDPK38包含CDPKs家族典型的4个蛋白结构域即N-端可变域、蛋白激酶域、自抑制域和类钙调素结合域。其中，在类钙调素结合域中含有2个EF hands, 在蛋白激酶域包含Ser/Thr蛋白激酶结构域。图3

研究表明，3个Motif氨基酸的保守序列分别为：Motif1(VDFEEFVAATLHVHQLVEHDTEKWKSLSQ)Motif2(VRQMLKVAAECHLHGLVHRDMKPENFLFK)Motif3(VKREVKILKALQGHENVVHFY NAFEDDNY)，在8个CDPK中具有高度保守性。图4

2.3 ZmCDPK38在不同组织中的表达模式

研究表明，该基因在所有组织中均有表达，但转录水平存在显著差异，其中该基因在叶片中的表达高于其它组织，其次是在茎部；在根、雌穗和雄穗的表达水平显著低于其它组织，根中的转录水平略高于雌穗和雄穗。图5

2.4 ZmCDPK38基因在不同非生物胁迫条件下的表达

研究表明，ZmCDPK38在高温条件下的转录水平未发生较明显的变化，在高温处理24 h后表达水平下调明显，故该基因并未受高温胁迫诱导表达。盐胁迫条件下，随着胁迫时间的延长，ZmCDPK38的转录受到诱导表达上调，在处理3 h后达到峰值，转录水平是对照的3.2倍。尽管随着胁迫时间的延长表达量有所下降，但是表达水平仍高于对照，因此，可以初步判断该基因的表达受盐胁迫诱导。另外在干旱胁迫条件下，ZmCDPK38的转录水平随着胁迫时间的延长不断上调，并且在胁迫6 h后表达量达对照的9.5倍，该基因的表达受到干旱胁迫的诱导。图6

3 讨 论

玉米等植物为适应各种外界环境刺激形成了复杂的逆境胁迫信号传导机制，其中Ca2+被认为作为植物特有的第二信使主要参与植物非生物胁迫信号的传导，Ca2+通过钙结合蛋白介导将胁迫信号传递到调控通路的下游，钙依赖蛋白激酶(CDPK)作为钙结合蛋白之一在植物抵抗逆境胁迫的调控反应中发挥着重要作用[14]。从玉米中分离得到了ZmCDPK38基因，利用生物信息学方法对该基因分析后发现它与其它6个物种的CDPK家族成员在氨基酸序列和蛋白结构上存在较大的相似性，具有CDPK家族典型的类钙调素结合域，这也是CDPKs和其他类型蛋白激酶存在区别的区域[15]。ZmCDPK38基因的表达具有组织特异性，这一表达特性也存在与其它物种中的CDPKs，例如小麦TaCDPK13基因在叶、幼穗以及未成熟的种子中表达，而在根、茎中则未见表达[11]；拟南芥AtCPK17和AtCPK34基因主要在花粉管形成期表达，并参与调控花粉管的生长[16]；水稻OsCDPK6基因在花粉管形成阶段转录水平上调[17]。研究表明，当植物受到生物胁迫或非生物胁迫时，CDPKs基因的转录水平发生改变，并且不同CDPK基因分别对不同胁迫产生应答。例如拟南芥受盐和干旱胁迫后，AtCDPK1和AtCDPK2基因表达上调，而在低温胁迫下，其基因表达均没有显著变化；AtCDPK4 和AtCDPK11基因受ABA诱导表达，正向调节ABA介导的信号途径，而AtCPK12基因在ABA信号途径中则作为负向调控因子[18]。水稻OsCDPK7基因在冷、盐、干旱胁迫条件下的表达发生改变，水稻耐低温、盐和干旱胁迫的程度与OsCDPK7基因的表达水平有密切关系[19]。ZmCDPK38同样对不同的非生物胁迫产生一定的应答反应，在研究中，ZmCDPK38主要响应干旱和盐胁迫，但在高温和低温胁迫下表达没有显著变化，暗示该基因在玉米应对干旱和高盐胁迫的反应中扮演一定的角色。但是，ZmCDPK38基因是否在玉米中发挥耐旱和耐盐具备实际功能有待深入研究。

4 结 论

ZmCDPK38与ZmCDPK28及高粱等6个其它植物物种的CDPK的氨基酸序列具有较高的一致性，遗传进化关系上较近。氨基酸序列包含4个结构域，具有CDPKs家族氨基酸的典型特征，Ser/Thr蛋白激酶结构域相对保守。ZmCDPK38基因虽然在玉米的不同组织均有表达，但是表达水平具有组织特异性，在叶片的表达水平高于根、茎、雄蕊和雌蕊。在不同非生物胁迫下，ZmCDPK38基因的表达差异显著，其表达受干旱及盐胁迫诱导，而不受低温和高温的诱导。