蒲公英与葵花籽仁提取绿原酸的协同抗氧化作用

王文华，郭丽，刘爽

1. 上海震旦职业学院（上海 201908）；2. 绥化学院食品与制药工程学院（绥化 152061）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand-Mazz）是菊科多年生植物[1]，富含绿原酸、咖啡酸、生物碱、多糖等多种功能成分[2]，是良好的药食两用佳品。大量研究表明，蒲公英提取物具有抑菌[3-4]、抗炎[5]、止血[6-7]、护肝[8-9]、抗癌[10-12]、抗氧化[13-17]等作用。

葵花籽中绿原酸主要分布在葵花籽仁的糊粉层中或细胞的蛋白质颗粒内。去油后的葵花籽粕中绿原酸含量高于其他油料作物，达到2.8%左右[18]。研究发现，葵花籽中绿原酸是其主要的抗氧化活性物质[19-20]。

试验以蒲公英和葵花籽为原料，以其中的活性物质绿原酸为主要研究对象，研究不同温度（5，25，37和45 ℃）和不同pH（2.0，4.0，6.0，7.0和8.0）条件下蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液的抗氧化活性。在此基础上探究蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液复配的抗氧化活性，为开发天然、高效的新型复合抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英、葵花籽：市售。

试剂：绿原酸标准品（纯度≥98%），Summus公司；ABTS（纯度≥98%，2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐），北京酷尔化学科技有限公司。

1.2 试验仪器与设备

KQ-200VDE双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FW135高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3C精密酸度计，杭州齐威仪器有限公司；DL-6000B低速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；DZ-1BC真空干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；752紫外-可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 试验内容

1.3.1 绿原酸的提取

将蒲公英表面灰尘清洗后，置恒温干燥箱中40 ℃干燥至恒质量，经万能粉碎机粉碎后过孔径0.250 mm筛，密封保存，备用。用分析天平称取4.000 0 g蒲公英干燥粉末于三角瓶中，加入80 mL体积分数60%乙醇溶液，采用超声波辅助提取蒲公英中绿原酸。提取条件：超声功率80 W，超声处理110 min，提取温度60 ℃，用滤布过滤后备用。

将葵花籽去皮后置恒温干燥箱中60 ℃干燥至恒质量，经万能粉碎机粉碎后过孔径0.250 mm筛，根据GB 5009.6—2016中索氏抽提法除去葵花籽仁中脂肪，再经真空干燥后备用。称取4.000 0 g的脱脂干燥葵花籽仁粉末于三角瓶中，加入80 mL体积分数50%乙醇溶液，采用乙醇浸提法提取葵花籽仁中绿原酸，提取pH 6.0，提取温度50 ℃，提取时间2 h，于3 000 r/min下离心20 min，取上清液备用。

1.3.2 绿原酸提取液抗氧化研究

研究不同温度（5，25，37和45 ℃）和pH（2.0，4.0，6.0，7.0和 8.0）条件下蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液的抗氧化活性。通过蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液的抗氧化动力学实验研究，根据2种样品绿原酸提取液单独作用时的 IC50值，将蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液进行复配，比例分别为1∶9，2∶ 8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1，利用ABTS自由基清除法对两者协同抗氧化能力进行研究。

1.4 测定方法

1.4.1 绿原酸含量的测定

1.4.1.1 标准曲线的制作

用分析天平准确称取5.3 mg绿原酸标准品，用60%乙醇定容于100 mL容量瓶中备用，质量浓度为0.053 mg/mL。分别吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，用紫外分光光度计于325 nm波长下测定吸光度，做平行试验，并以绿原酸标准溶液的浓度为横坐标，所测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.1.2 样品测定

准确吸取1.0 mL蒲公英提取液，用60%乙醇定容至10 mL容量瓶中，即为蒲公英绿原酸待测液；从葵花籽仁提取液中准确吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，在pH 6.0的条件下，用50%乙醇定容即为葵花籽绿原酸待测液，在325 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算待测液中绿原酸含量。

1.4.2 绿原酸抗氧化活性测定

ABTS自由基清除能力测定：参照Re等[21]的方法，并稍作修改。分别用超纯水配制25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和25 mL 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，将两者混合后置于避光处16～24 h制备ABTS反应液，采用不同pH的缓冲溶液对ABTS反应液进行稀释，使其在波长734 nm下测得的吸光度为0.70±0.02；用移液器准确吸取30 μL的样品提取液和3 mL 稀释后的ABTS反应液于避光离心管中，分别置于5，25，37和45 ℃下反应5 min，以不同pH缓冲液作为空白对照，并于波长734 nm下测定吸光度。

ABTS自由基清除率按式（1）计算。

式中：I为ABTS自由基清除率，%；A0为空白对照反应后的吸光度，AS为蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液分别反应后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 蒲公英、葵花籽仁中绿原酸含量

以绿原酸浓度为横坐标、吸光度（A）为纵坐标，得出绿原酸标准曲线方程：y=37.09x+0.031，R2=0.994。绿原酸标准品在0～0.024 mg/mL的浓度范围内与吸光度有良好的线性关系，见图1。

图1 绿原酸标准曲线

通过标准曲线方程计算得出蒲公英提取液中绿原酸含量为4.5%，葵花籽仁提取液中绿原酸含量为1.2%。吴婉瑾等[22]通过乙醇回流法测得不同生态型蒲公英中绿原酸含量范围在2.21%～7.03%，与试验结果相一致；胡鲜宝等[23]利用乙醇提取法提取葵花粕中绿原酸，提取率为2.57%，可见脱脂程度不同对绿原酸含量有所影响。

2.2 蒲公英绿原酸提取液对ABTS自由基的清除能力

ABTS是目前常用来评价抗氧化剂清除自由基能力的重要方法之一。ABTS在氧化剂的作用下会氧化变为绿色，而多酚类物质因能提供氢离子，将绿色的ABTS还原为无色，在734 nm波长下，通过测定ABTS溶液的吸光度即可计算出样品中绿原酸的抗氧化能力。

蒲公英绿原酸提取液在pH为2～8时，提取液对ABTS自由基的清除率随着pH增大，呈现先升高后降低的趋势，见图2。

图2 不同条件下蒲公英提取液绿原酸对ABTS自由基的清除能力

当绿原酸提取液的pH为6.0时，其对ABTS自由基清除能力最大，这主要是由于绿原酸的第一解离常数pKa1为0.36，在提取液pH低于解离常数时，绿原酸被质子化不能进行解离来猝灭ABTS自由基；当提取液pH高于第一解离常数时，促使绿原酸分子酚羟基的电离效率进一步放大，使其抗氧化能力增加。当绿原酸提取液pH为2.0时，其对ABTS自由基清除能力最差，绿原酸分子在pH 2.0时的溶解度很低，强酸环境限制了绿原酸分子结构的水合解离，导致其抗氧化能力较低[24]。绿原酸提取液pH为4.0，7.0和8.0时，其对ABTS自由基清除能力差异不明显。

蒲公英绿原酸提取液在浓度为0.225～2.025 mg/mL范围时，绿原酸提取液对ABTS自由基清除率随着温度的升高，呈现出逐渐递增的趋势，见图3。

在相同浓度下，反应温度为45 ℃时，蒲公英绿原酸提取液对ABTS自由基清除作用均高于5，25和37 ℃。当提取液绿原酸浓度为2.025 mg/mL、反应温度为45 ℃时，提取液绿原酸对ABTS自由基清除作用最强，清除率为91.78%，而反应温度为5 ℃时，提取液绿原酸对ABTS自由基清除能力最弱，为90.58%。

图3 pH 6.0不同温度下蒲公英提取液绿原酸对ABTS自由基的清除能力

葵花籽仁绿原酸提取液在pH为2～8时，提取液对ABTS自由基的清除率随着pH的增大，呈现出先升高后降低的趋势，见图4。

图4 不同条件下葵花籽仁绿原酸对ABTS自由基的清除能力

当绿原酸提取液的pH为6.0时，其对ABTS自由基清除能力最好，可能是绿原酸分子在pH 6.0的条件下其内部的酚羟基结构电离度更高，更有利于终止ABTS自由基的连锁反应。当绿原酸提取液pH为2.0时，其对ABTS自由基清除能力最差，可能在强酸体系下绿原酸的溶解性会受到一定程度的干扰，使部分绿原酸质子化带正电，而造成绿原酸抗氧化活性的显著降低[24]。绿原酸提取液pH为4.0，7.0和8.0时，其对ABTS自由基清除能力差异不明显。

葵花籽仁绿原酸提取液浓度在0.054～2.7 mg/mL范围时，其对ABTS自由基清除能力随着温度的升高，呈现逐渐递增的趋势，见图5。

在相同浓度下，反应温度为45 ℃时，葵花籽仁绿原酸提取液对ABTS自由基清除作用最好，均高于5，25和37 ℃时提取液对ABTS自由基的清除率。当提取液绿原酸浓度为2.7 mg/mL，反应温度为45 ℃时，提取液绿原酸对ABTS自由基清除能力最强，清除率达到90.51%。提高温度后绿原酸分子的解离度增加，促使绿原酸分子和自由基之间的碰撞概率增大[24]。

图5 pH 6.0不同温度下葵花籽仁绿原酸对ABTS自由基的清除能力

2.3 ABTS自由基的清除能力回归方程

IC50表示达到半数抑制率或者半数清除自由基活性时的物质浓度，常用来表示物质的抗氧化活性，物质的IC50越小，表明物质的抗氧化活性越强，反之亦然。

确定在pH 6.0条件下，蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液对ABTS自由基清除能力最佳，分析不同温度下、不同浓度绿原酸提取液的抗氧化活性。不同反应温度下，葵花籽仁绿原酸提取液的IC50值均显著高于蒲公英绿原酸提取液的IC50值。随着反应温度的升高，IC50值均呈现明显下降的趋势，见表1。

表1 pH 6.0时不同反应温度下绿原酸ABTS自由基清除能力回归方程

在温度为45 ℃时蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液的IC50值分别为0.071 933和0.938 96，是5 ℃时IC50值的48%和41%，可见温度升高显著提升了绿原酸的抗氧化活性。反应温度升高会提升反应发生的速度，但不改变达到平衡时的抗氧化活性，可能提高温度后绿原酸在体系中的分散度和电离电势增大[24]。

2.4 绿原酸复配体系对ABTS自由基清除能力研究

协同抗氧化作用的发生不仅与抗氧化剂分子本身的抗氧化特性有关，还与规整有序的分子排列体系有关，有序性缩短了分子之间的接触距离和电子以及氢原子的传递路径，从而促进协同抗氧化现象发生。

为研究蒲公英绿原酸与葵花籽仁绿原酸对清除ABTS自由基的协同效应，将2种样品中绿原酸提取液用pH 6.0缓冲液稀释至最适浓度后，按比例（1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1）混合，测定样品组合清除ABTS自由基的能力，判定协同关系。

复配液对ABTS自由基的清除能力均大于蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液单独对ABTS自由基的清除能力，蒲公英绿原酸提取液对ABTS自由基的清除能力相对于葵花籽仁绿原酸提取液较弱，见图6。随蒲公英绿原酸提取液浓度的增加，复配液对ABTS自由基的清除率呈缓慢递增的趋势，当蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液体积比为7∶3时，在所有的比例组合中显示出较强的协同抗氧化作用，反应温度大于37 ℃时，复配液的协同抗氧化能力保持较高水平。

图6 不同复配比例对ABTS自由基的清除能力

3 结论

试验是在不同温度和不同pH条件下，以蒲公英和葵花籽仁绿原酸为原料，研究蒲公英和葵花籽仁绿原酸单独作用时对ABTS自由基的清除能力，并分析复配体系的抗氧化能力。得到主要结论如下：

1) 反应体系的pH和温度对蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液对ABTS自由基清除能力具有显著性影响，两种样品液在pH 6.0和45 ℃条件下抗氧化活性最佳，分别为91.78%和90.51%。

2) 在复配体系中，当蒲公英和葵花籽仁绿原酸提取液体积比为7∶3时ABTS自由基清除能力最强，为91.74%。蒲公英和葵花籽仁绿原酸具有协同抗氧化能力。