铁皮石斛花色苷提取及其抗氧化活性分析

杨晓娜，陈自宏，谢雯颖，吴春燕，张星和

保山学院资源与环境学院（保山 678000）

花色苷是植物次生代谢过程中产生的类黄酮物质，它是花色素与糖以糖苷键结合而成的天然色素，不仅安全，且在动脉粥样硬化、炎症、癌症等疾病中有一定的治疗作用[1]。国内外科研工作者已对不同植物花色苷的提取工艺做了大量的研究，微波加热使细胞内极性物质吸收微波能，产生热量，破坏植物细胞壁，并将胞内物质释放出来[3]。经查阅文献，植物花色苷微波辅助提取及其抗氧化性研究成果较多，主要集中在紫洋葱[4]、石榴[5]、红米[6]、紫薯[7]、紫马铃薯[8]、黑果枸杞[9]等植物，但是微波辅助提取铁皮石斛花色苷及其抗氧化性研究鲜有报道。

云南省保山市是我国兰科石斛属植物分布较集中的地区之一，独特的气候条件和多样的生态环境，为石斛属植物的生长提供了有利条件[2]。目前，对石斛的研究主要集中在资源、繁殖生长、活性成分及功能、组织培养、资源鉴定与评价、化学成分、内生菌、药理作用等方面。通过对保山不同品种石斛的调研，发现铁皮石斛叶鞘富含天然色素花色苷。

因此，此次试验在传统浸泡法基础上，加以微波辅助提取铁皮石斛花色苷，并对其进行抗氧化性研究，以了解铁皮石斛花色苷用微波辅助提取的工艺及其对清除DPPH自由基和羟自由基的抗氧化能力，为石斛天然色素开发提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛采自龙陵县龙江乡石斛人工种植基地，选用长势好、无病虫害的铁皮石斛叶鞘作为试材，自然干燥后用粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存，备用。无水乙醇、盐酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、水杨酸、过氧化氢等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DFY-800 g摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；DK-8AX电热恒温水槽（上海一恒科技仪器有限公司）；G70F20N2L-DG（SO）微波（广东格兰仕微波炉电器制造有限公司）；N-1001旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；HC-2062离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；SHZ-DⅢ循环水真空泵（巩义市子华仪器有限责任公司）；UV5100紫外/可见分光光度计（安徽皖仪科技股份有限公司）；CP114电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛花色苷含量测定及最大吸收波长的确定方法

称取1 g铁皮石斛叶鞘粉末，加入30 mL 0.1%盐酸乙醇（乙醇体积分数为40%）浸泡1 h，然后在微波辐射功率406 W、辐射时间60 s条件下处理，抽滤，将提取液置于紫外-可见分光光度计200～700 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长[10]。

用pH示差法测定花色苷的含量[11]，分别用pH 1.0的KCl和pH 4.5的乙酸钠缓冲液定容至25 mL，室温下平衡20 min，测定2份样品在λmax和700 nm波长处的吸光度。吸光度及紫皮石斛提取液中花色苷含量按式（1）和（2）计算。

式中：V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.4；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔消光系数，26 900；m为样品质量，g。

1.3.2 浸泡时间

称取6份1 g铁皮石斛叶鞘粉末，加入30 mL 0.1%盐酸乙醇（乙醇体积分数为40%），分别浸泡0，1，2，3，4和5 h，然后在微波辐射功率406 W、辐射时间60 s条件下处理，抽滤，测定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.3 乙醇体积分数

称取5份1 g铁皮石斛叶鞘粉末，分别加入30 mL 0.1%盐酸乙醇，乙醇体积分数分别为30%，40%，50%，60%和70%，浸泡1 h，然后在微波辐射功率406 W，辐射时间60 s条件下处理，抽滤，测定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.4 料液比

称取5份1 g铁皮石斛叶鞘粉末，分别加入20，25，30，35和40 mL 0.1%盐酸乙醇（乙醇体积分数均为40%），浸泡1 h，然后在微波辐射功率406 W、辐射时间60 s条件下处理，抽滤，测定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.5 辐射时间

称取5份1 g铁皮石斛叶鞘粉末，加入30 mL 0.1%盐酸乙醇（乙醇体积分数为40%），浸泡1 h，然后在微波辐射功率406 W、辐射时间分别为30，60，90，120和150 s条件下处理，抽滤，测定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.6 辐射功率

称取4份1 g铁皮石斛叶鞘粉末，加入30 mL 0.1%盐酸乙醇（乙醇体积分数为40%），浸泡1 h，然后在辐射时间60 s，微波辐射功率分别为126，406，567和700 W条件下处理，抽滤，测定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.7 正交试验方法

在单因素试验的基础上，选择浸泡时间、乙醇体积分数、料液比、辐射时间、辐射功率进行五因素四水平正交试验设计，采用L16(45)正交表进行试验，以提取液中花色苷含量为考察指标，确定最佳工艺参数。

表1 正交因素水平

1.3.8 DPPH清除自由基能力的测定方法

称取0.019 7 g DPPH，用无水乙醇定容至100 mL，避光保存，备用。将花色苷溶液用二倍稀释法稀释5组，备用。按表2中试验内容，在比色管中将溶液混匀，避光室温保存30 min后，定容至10 mL，在517 nm波长处测吸光度，重复3次试验，计算清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%和IC50值清除率。采用VC作对照，VC的浓度和花色苷相同，同样采用二倍稀释法配制5组不同浓度的VC溶液。操作步骤和计算公式与花色苷一致。

表2 DPPH清除自由基能力测定方法

1.3.9 羟自由基清除能力的测定方法

分别配置6 mmol/L水杨酸（称取0.041 4 g水杨酸，用无水乙醇定容50 mL）、6 mmol/L硫酸亚铁（称取0.083 4 g硫酸亚铁，用蒸馏水定容50 mL）和0.3%过氧化氢溶液（移取0.5 mL 30%过氧化氢，用蒸馏水定容50 mL，现配）。用A0组的混合液在200～700 nm下测定最大吸收波长。按表3的试验内容在比色管中将A0组、A1组、A2组溶液加好后，在37 ℃进行水浴加热30 min，再用蒸馏水定容至10 mL，在紫外/可见分光光度计测λmax的吸光度A，重复3次试验，计算清除率= [1-（A1-A2）/A0]×100%和IC50值清除率。采用VC作对照，VC的浓度和花色苷相同，同样采用二倍稀释法配制5组不同浓度的VC溶液。操作步骤和计算公式与花色苷一致。

表3 羟自由基清除能力测定方法

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛花色苷最大吸收波长的确定

从图1可以看出，铁皮石斛最大吸收波长为530 nm。王立江等[12]以黑马铃薯鲜样为试验材料，采用微波辅助有机溶剂提取法对黑马铃薯中花色苷的提取工艺条件进行优化，黑马铃薯花色苷的最大吸收波长在536 nm处。蒋海伟等[13]采用酸化乙醇作为提取剂，微波辅助提取红米中花色苷，其最大吸收波长在517 nm。任虹等[14]研究蒸汽加热和微波加热处理对紫甘蓝花色苷及其清除自由基活性的影响，紫甘蓝花色苷最大吸收波长在500 nm处。根据文献可知花色苷及其色素元在可见光465～550 nm波长范围内有吸收峰[15]。由此可以判断铁皮石斛色素属花色苷[16]。

图1 铁皮石斛花色苷可见光谱图

2.2 单因素对花色苷提取的影响

2.2.1 浸泡时间对花色苷提取的影响

由图2可知，当浸泡时间小于4 h时，随着浸泡时间的增加，铁皮石斛花色苷的提取含量逐渐增大；当浸泡时间超过4 h后，铁皮石斛花色苷的含量又开始下降，其原因可能是浸泡时间过长，提取剂过多进入细胞，加以微波辅助提取，细胞内其他物质不断被提取出来，影响花色苷的含量。所以，浸泡时间4 h为提取铁皮石斛花色苷最适宜的浸泡时间。

2.2.2 乙醇体积分数对花色苷提取的影响

由图3可知，当乙醇体积分数在30%～50%之间，铁皮石斛花色苷提取含量随乙醇体积分数增大而增大，且当乙醇体积分数为50%时，铁皮石斛花色苷的含量最高。但当乙醇体积分数超过50%时，增大乙醇体积分数，花色苷含量反而呈下降趋势。其原因可能是乙醇体积分数过高，将铁皮石斛中其他易溶于乙醇的有机物也一起提取出来。所以，乙醇体积分数50%作为提取铁皮石斛花色苷的最佳提取剂乙醇体积分数。

图2 浸泡时间对铁皮石斛花色苷含量的影响

图3 乙醇体积分数对铁皮石斛花色苷含量的影响

2.2.3 料液比对花色苷提取的影响

由图4可知，料液比在1∶20～1∶25（g/mL）内，随着提取剂体积的增加，花色苷含量逐渐增大，且上升很大。但是继续增加提取剂体积，花色苷含量缓慢下降。其原因可能是料液比大，提取剂体积大，加热时间长，温度高，使得花色苷降解。倘若一开始料液比过大，则不利于下一步的浓缩分离以及增加后面的工作能耗，所以结合经济角度考虑，选择1∶25（g/mL）作为最佳料液比。

2.2.4 辐射时间对花色苷提取的影响

由图5可知，当辐射时间为30～60 s时，花色苷含量呈上升趋势。在60～120 s，花色苷含量呈下降趋势；但在120 s之后，增大辐射时间，花色苷含量又上升。其原因可能是在辐射时间在60～120 s时，加热时间过长，加热温度升高，使花色苷受到一定的破坏；在150 s，花色苷含量又增大，可能是因为微波提取过程中，电磁波把能量直接传递到铁皮石斛内部并快速加热，使温度快速升高，使得一些未溶于提取剂的其他色素溶解一并被提取出来，增大花色苷含量。但是从节约资源、省时、省电角度考虑，150 s耗时过长，而且后期提纯工艺较繁琐，所以选择60 s作为最适提取时间。

图4 料液比对铁皮石斛花色苷含量的影响

图5 辐射时间对铁皮石斛花色苷含量的影响

2.2.5 辐射功率对花色苷提取的影响

由图6可知，微波功率在126～567 W内，随着微波提取功率的增加，铁皮石斛花色苷含量呈逐渐上升的趋势，且在567 W时花色苷含量最高。但是，继续增加微波提取功率，其含量增加呈缓慢下降的趋势，这是由于微波功率过大易造成温度过高，使部分花色苷分解，进而降低花色苷的提取含量。所以选择567 W为提取最适功率。

2.3 铁皮石斛花色苷正交试验结果分析

由表4可知，采用微波辅助提取铁皮石斛花色苷，在5个单因素影响中，乙醇体积分数极差为0.037，是对提取花色苷含量影响最小的，而料液比极差最大，影响也最大，为主要影响因素，各因素对提取花色苷含量的影响依次是料液比＞辐射时间＞浸泡时间＞乙醇体积分数＞辐射功率。综合所有试验结果，试验最终确定的最佳参数为乙醇体积分数为50%，料液比为1∶20（g/mL），辐射功率为406 W，辐射时间为90 s，浸泡时间为4 h。从表5中可以看出，4个因素显著水平值均为极显著，说明这4个因素对试验的结果有显著影响。

图6 微波功率对铁皮石斛花色苷含量的影响

表5 方差分析

表4 正交试验及结果

2.4 最佳工艺条件验证试验、提取次数

根据正交试验可知，最佳提取工艺参数为A2B1C2D3E4，即乙醇体积分数为50%，料液比为1∶25（g/mL），微波功率为406 W，辐射时间90 s，浸泡时间4 h，按此试验条件再进行3次重复试验，提取铁皮石斛花色苷含量为0.452，0.435和0.392 mg/g，3组铁皮石斛花色苷含量与正交试验中第5组含量相差不大，说明该组试验提取稳定，因此确定A2B1C2D3E4为最佳提取工艺。

由图7可知，当提取条件为A2B1C2D3E4时，提取2次，铁皮石斛花色苷含量最高，为1.052 mg/g，花色苷质量浓度为35.07 mg/L；提取3次时，花色苷含量又降低，但含量比提取1次含量高。提取3次，铁皮石斛花色苷含量有所下降的原因可能是：提取2次，铁皮石斛滤渣已呈无色，第3次同样条件提取，提取液几乎呈无色，花色苷色素几乎提取完毕，再次提取，反而将滤渣中的多糖或者其他成分提取出来，影响最终的花色苷的含量。所以3最终确定以提取次数2次最佳。

图7 提取次数对铁皮石斛花色苷含量的影响

2.5 铁皮石斛花色苷对羟自由基的清除能力

羟自由基是人体内危害性较强的一种自由基，与机体内分子失电子或电子转移，来影响机体正常的生理功能。硫酸亚铁被过氧化氢氧化为Fe3+，再与水杨酸反应形成紫色络合物，加入自由基清除剂后，紫色络合物颜色变浅，且清除剂浓度越高，颜色越浅。由图8可知，铁皮石斛花色苷质量浓度在2.2～35.07 μg/mL范围内，花色苷质量浓度增大，清除率越大，呈上升趋势，而VC的清除率趋于平缓，当花色苷质量浓度达到35.07 μg/mL时，清除率达到97.8%。用SPSS 18.0软件分析IC50得：铁皮石斛花色苷的IC50（7.61 μg/mL）＞VC的IC50（5.56×1020μg/mL）。铁皮石斛花色苷具有较强的清除羟自由基的能力，抗氧化能力强于VC。

2.6 铁皮石斛花色苷对DPPH自由基的清除能力

DPPH是一种紫红色物质，DPPH自由基溶于乙醇且能稳定存在，当有自由基清除剂加入与之结合，会使颜色变浅，且与清除剂浓度呈一定的量效关系。由图2可知，铁皮石斛花色苷质量浓度在0.3～35.07 μg/mL范围内，花色苷浓度增大，清除率越大，呈上升趋势，而VC的清除率趋于平缓，当花色苷质量浓度达到35.07 μg/mL时，清除率达到97.8%，VC清除率为56.7%。用SPSS 18.0软件分析IC50得：铁皮石斛花色苷的IC50（0.53 μg/mL）＞VC的IC50（74.46 μg/mL）。铁皮石斛花色苷具有较强的清除DPPH自由基的能力，抗氧化能力强于VC。

图8 铁皮石斛花色苷及VC对羟自由基的清除能力比较

图9 铁皮石斛花色苷及VC对DPPH的清除能力

3 结论

此次试验利用浸泡-微波辅助联合方法提取铁皮石斛花色苷，得出铁皮石斛花色苷的最大吸收波长，为530 nm；由单因素试验及正交试验结果可知，各因素对提取花色苷含量的影响依次是料液比＞辐射时间＞浸泡时间＞辐射功率＞乙醇体积分数。最佳提取参数为乙醇体积分数50%，料液比为1∶20（g/mL），辐射功率406 W，辐射时间90 s，浸泡时间4 h，提取次数2次。此时，铁皮石斛花色苷含量最高，为1.052 mg/g，花色苷质量浓度为35.07 mg/L。通过软件分析IC50，铁皮石斛花色苷对清除羟自由基和DPPH自由基的IC50分别为7.61和0.53 μg/mL。VC对清除羟自由基和DPPH自由基IC50分别为5.56×1020和74.46 μg/mL。铁皮石斛花色苷对DPPH自由基和羟自由基均有较强的抗氧化能力，抗氧化效果均强于VC，且抗氧化能力与花色苷浓度显现出一定的正比关系，但对DPPH自由基的抗氧化能力要强于羟自由基。