CDCA7通过与MCM3相互作用介导胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移

邓 路 ，何志伟 ，朱昌毫，陈世裕，刘燕青，李 琳，孙诚谊，喻 超

[作者单位]1.贵州医科大学临床医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院肝胆外科，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学肝胆胰脾重点实验室，贵州 贵阳 550004；4.贵州省肝胆胰脾疾病研究所，贵州 贵阳 550004

胰腺癌的恶性程度高，2019年美国肿瘤年度报告指出，胰腺癌死亡率在所有肿瘤中位列第6，5年生存率低于7%[1]。随着临床医疗水平的提高，针对胰腺癌患者的系统治疗也在不断地改善。目前认为，早期手术切除是治疗胰腺癌最有效的方式，但由于胰腺癌发病隐匿，早期诊断极为困难，大多数患者在确诊时已错过了最佳的手术时机[2]。而且胰腺癌发展迅速，预后差，其原因是胰腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力很强[3]。因此，研究胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的生物学功能和分子机制有助于阐明胰腺癌的发生和发展过程，利于早期诊断和治疗。

细胞分裂周期相关蛋白7（cell division cycleassociated protein 7，CDCA7）基因又名JPO1，是一种新型c-Myc应答基因，定位于人染色体2q31上，编码由371个氨基酸组成的核蛋白[4]。JPO1基因在细胞周期中周期性表达，在G1和S期之间达到最高水平，2005年被人类基因组命名委员会正式命名为CDCA7[5]。研究发现，CDCA7与Myc具有关联，而且这种关联受磷酸化依赖方式调节。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）可使CDCA7的第163位点苏氨酸发生磷酸化，促进与14-3-3蛋白（14-3-3 proteins，14-3-3）的结合，与Myc分离，并被转运到细胞质中[6]。以往对CDCA7基因的研究主要集中在CDCA7和Myc之间的相互作用上[4,6-7]，而对CDCA7基因本身的功能和机制研究较少。已有研究表明，CDCA7基因是转录因子Myc和E2F转录因子1（E2F Transcription Factor 1，E2F1）的下游靶基因，参与细胞周期过程，可作为很多基因的表达转录调控因子，提示其很可能通过调控某一基因的表达来调控细胞的增殖或凋亡，从而引起肿瘤的发生和发展[8]。

近年来，有研究者相继报道了CDCA7基因在人类肿瘤中的表达情况[9-11]，发现各种肿瘤中CDCA7的表达量均有显著增高，但是CDCA7基因是否参与胰腺癌的发生和发展尚待进一步研究。本研究主要从增殖、侵袭及转移等方面探讨CDCA7在胰腺癌中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人正常胰腺导管上皮细胞HPDE和人胰腺癌细胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990细胞均由武汉华中科技大学同济医学院胆胰实验室惠赠。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM及RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司。兔抗人CDCA7多克隆抗体购自美国Affanity公司，兔抗人微型染色体维持蛋 白3（minichromosome maintenance protein 3，MCM3）多克隆抗体、兔抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体、小鼠抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）单克隆抗体、兔抗人细胞周期蛋白D1（cyclin D1）单克隆抗体和小鼠抗人cyclin E1单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，鼠抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔IgG（二抗）、高灵敏化学发光检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Protein A＋G琼脂糖和CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司，基质胶（Matrigel）购自美国BD公司，RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒及SYBR Premix ExTaq试剂盒均购自日本TaKaRa公司。携带CDCA7-shRNA的重组慢病毒及阴性对照病毒、HitransG A病毒感染试剂购自上海吉凯基因化学技术有限公司；CDCA7-shRNA（CDCA7-shRNA1序列：5’-GACTATTGATACCAAAACA-3’，CDCA7-shRNA2序列：5’-GTGCATGCCTACTTGAAAA-3’，CDCA7-shRNA3序列：5’-CCAACTCCGATTCAGAAGA-3’）。CDCA7基因引物由武汉天一辉远生物科技有限公司设计并完成；CDCA7基因上游引物序列为5’-GAGAACGTCTGCAGCAATTC-3’，下游引物序列为5’-ATCCCTGACCTCTTCACCATA-3’；GAPDH基因（内参照）上游引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2 生物信息学分析

利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn）网站，依次选择Expression Analysis和Genaral，输入基因名称CDCA7，分析数据库中各种肿瘤组织和正常组织中CDCA7的表达水平；进一步在GEPIA网站中选择Expression DIY，输入基因名称CDCA7，选择胰腺导管腺癌数据库PAAD，在线分析CDCA7在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达。利用STRING网站（https://version11.string-db.org）在线分析，选择胰腺导管腺癌数据库PAAD，输入基因名称CDCA7，进行数据库分析，结果显示CDCA7与MCM3存在相互作用；进一步利用GEPIA数据库网站，依次选择Correlation Analysis和胰腺导管腺癌数据库PAAD，输入CDCA7和MCM3，在线分析CDCA7和MCM3蛋白存在相关性。

1.3 细胞培养

人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE和人胰腺癌细胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990细胞分别用含10%胎牛血清的DMEM及RPMI 1640培养液培，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温恒湿培养箱中进行培养。

1.4 实时荧光定量PCR检测人正常胰腺导管上皮细胞和胰腺癌细胞中CDCA7 mRNA的表达水平

收集处于对数生长期的各组细胞（人正常胰腺导管上皮细胞HPDE和人胰腺癌细胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990细胞），提取细胞总RNA，选取D260nm/D280nm值在1.8～2.0的样品进行PCR扩增。取800 ng总RNA，反转录为cDNA；反转录体系（20 μL）：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript反转录酶混合液1 μL，Oligo dT引物1 μL，随机的6核苷酸引物1 μL，总RNA 800 ng，然后用无酶水补充体积至20 μL。按照反转录试剂盒的说明，将200 μL无酶EP管置于反转录仪器内，条件参数设置为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，将样品反转录为cDNA。再选择GAPDH基因作为内参，使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系：SYBR Premix Ex Taq 6.25 μL，CDCA7基因或GAPDH基因上下游引物各0.25 μL，cDNA 1.0 μL，无酶水4.75 μL；PCR扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。以2－ΔΔCt值表示目的基因的相对表达水平。

1.5 蛋白质印迹法检测人正常胰腺导管上皮细胞和胰腺癌细胞中CDCA7蛋白的表达水平

将生长状态良好的各组细胞（人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE和人胰腺癌细胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990细胞）用胰蛋白酶消化后，裂解细胞提取细胞总蛋白，将处理后的蛋白样品行SDSPAGE，电泳结束后将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭2 h；加入一抗[兔抗人CDCA7多克隆抗体和鼠抗人GAPDH单克隆抗体（体积稀释比例均为1∶1 000）]4 ℃反应过夜；随后加入二抗[辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔IgG（体积稀释比例均为1∶5 000）]进行反应，最后加入高灵敏电化学发光剂曝光、显影。以目蛋白条带与内参照GAPDH蛋白条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。

1.6 重组慢病毒感染

选取对数期生长的PANC-1细胞接种于6孔板中，调整细胞密度为1×105个/孔，用HitransG A病毒感染试剂进行重组慢病毒感染。实验分组如下：空白对照组，不对细胞进行处理的PANC-1细胞；阴性对照（negativecontrol，NC）-shRNA组，用NC-shRNA重组慢病毒感染PANC-1细胞；CDCA7-shRNA1组、CDCA7-shRNA2组和CDCA7-shRNA3组，分别用CDCA7-shRNA1、CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3重组慢病毒感染PANC-1细胞，构建CDCA7干扰组。感染流程严格按照HitransG A病毒感染试剂说明书进行操作，筛选稳定表达的细胞株，并分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测感染效率（检测流程参阅1.4节和1.5节）。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖

收集NC-shRNA组、CDCA7-shRNA2组和CDCA7-shRNA3组PANC-1细胞消化并计数，按照3×103个/孔的密度接种于96孔板中（每组细胞设置5个复孔），分别于24、48及72 h共3个时间点检测PANC-1细胞的增殖能力；每孔均加入CCK-8试剂10 μL，在避光条件下置于37 ℃恒温箱中孵育2 h，取出后轻微振荡摇匀，置于酶联免疫检测仪上450 nm波长处检测各孔的D值，并绘制生长曲线。

1.8 平板克隆实验

收集处于对数生长期的各组细胞（细胞分组同1.7节）消化并计数，以1×103个细胞/孔的密度接种于6孔板中，置于37 ℃恒温箱中培养10～14 d后，用4%多聚甲醛溶液固定20～30 min，再用0.1%结晶紫染液染色20～30 min，流水冲洗后置于烘干箱中烘干，拍照记录克隆生长情况，以＞50个细胞的克隆计为1个克隆。

1.9 细胞划痕愈合实验

收集处于对数生长期的各组细胞（细胞分组同1.7节）消化并计数，以4×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，待其均匀单层铺满至90%时，用200 μL移液器枪头置于各孔上方，沿直尺垂直均匀地划线，用PBS清洗划下的细胞，加入不含胎牛血清的培养液，分别于0、24及48 h时置于倒置光学显微镜（放大倍数为40倍）下拍照记录细胞的迁移距离。

1.10 细胞侵袭及迁移实验

收集处于对数生长期的各组细胞（细胞分组同1.7节）用无血清培养液饥饿处理24 h后消化计数，将Matrigel与无血清培养液按照1∶8的体积比例稀释，取60 μL稀释后的Matrigel铺在Transwell小室的上室膜上，待胶凝固后。在上室中接种1×105个/孔的细胞悬液200 μL，下室加入600 μL含20%胎牛血清的细胞培养液，置于37 ℃恒温箱中孵育24～48 h后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞20～30 min，再用0.1%结晶紫染液染色20～30 min，用棉签轻轻除去上室中未穿过小室的细胞，置于烘干箱中烘干；最后在倒置光学显微镜（放大倍数为400倍）选取5个视野拍照记录并计数穿过小室膜的细胞数。Transwell小室迁移实验中不铺设Matrigel，其余步骤同前述的侵袭实验。

1.11 蛋白质印迹法检测干扰CDCA7表达后对PANC-1细胞中上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）相关蛋和细胞周期蛋白表达水平的影响

收集处于对数生长期的各组细胞（细胞分组同1.7节）采用蛋白质印迹法检测PANC-1细胞中CDCA7、Vimentin、E-cadherin、cyclin D1和cyclin E1蛋白的表达水平，其中一抗分别为兔抗人CDCA7多克隆抗体、兔抗人Vimentin单克隆抗体、小鼠抗人E-cadherin单克隆抗体、兔抗人cyclin D1单克隆抗体、小鼠抗人cyclin E1单克隆抗体和鼠抗人GAPDH单克隆抗体（内参照）（体积稀释比例均为1∶1 000）；检测流程参阅1.5节。

1.12 免疫共沉淀实验

在PANC-1细胞中共转染pFlag-CDCA7和p-MCM3重组慢病毒，将生长状态良好的PANC-1细胞用胰蛋白酶消化后，裂解细胞抽提细胞总蛋白；加入20 μL充分重悬的Protein A＋G琼脂糖，4 ℃摇床2 h，加入2 μL兔抗人CDCA7多克隆抗体，4 ℃摇床上处理过夜；加入20 μL充分重悬的Protein A＋G琼脂糖，离心去除上清液，加入40 μL 2×上样缓冲液，将琼脂糖珠-抗原抗体复合物重悬沉淀，瞬时离心把样品离心至管底；95 ℃煮沸5 min，取部分或者全部样品用于SDS-PAGE，电泳结束后分别用兔抗人CDCA7多克隆抗体和兔抗人MCM3多克隆抗体检测CDCA7和MCM3蛋白的表达水平，检测流程参阅1.5节。

1.13 统计学方法

2 结果

2.1 人胰腺癌组织中CDCA7高表达

对TCGA和GEPIA数据库中的肿瘤相关数据分析结果（图1A）显示，CDCA7在各种类型的癌组织和正常组织中的表达水平均不同。进一步分析CDCA7在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达情况，结果（图1B）显示胰腺癌组织中CDCA7的表达水平明显提高（P＜0.05）。

2.2 人胰腺癌细胞系中CDCA7的表达情况

分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果胰腺癌细胞系中CDCA7 mRNA和蛋白的表达水平。实时荧光定量PCR法检测结果（图2A）显示，胰腺癌PANC-1、MIA PaCa-2和SW1990细胞的CDCA7 mRNA的表达水平均高于人正常胰腺导管上皮细胞HPDE中CDCA7 mRNA的表达水平（P值均＜0.05），而胰腺癌Bxpc-3、CFPAC-1和Capan2细 胞 中CDCA7 mRNA的表达水平则均低于人正常胰腺导管上皮细胞HPDE（P值均＜0.05）。蛋白质印迹法检测结果（图2B）同样显示，胰腺癌PANC-1、SW1990和MIA PaCa-2细胞中CDCA7蛋白的表达水平高于HPDE细胞，并以在PANC-1细胞中的表达水平最高。因此，选择PANC-1细胞进行后续实验。

2.3 重组慢病毒感染后PANC-1细胞中CDCA7 mRNA和蛋白表达水平的变化

实时荧光定量PCR法检测结果（图3A）显示，与空白对照组和NC-shRNA组相比，CDCA7-shRNA1组PANC-1细胞中CDCA7 mRNA的表达水平无明显变化，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3组中CDCA7 mRNA的表达水平均明显下调（P值均＜0.05）。

蛋白质印迹法检测结果（图3B）同样显示，与空白对照组和NC-shRNA组相比，CDCA7-shRNA1组PANC-1细胞中CDCA7蛋白的表达水平无明显变化，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3组中CDCA7 mRNA的表达水平均明显下调（P值均＜0.05）。

因此，选择CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3组用于后续CDCA7干扰后的细胞功能研究。

2.4 干扰CDCA7表达后PANC-1细胞增殖能力变化

CCK-8法检测结果（图4A）显示，48和72 h时，与NC-shRNA组相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3组PANC-1细胞的增殖能力明显降低（P＜0.05和P＜0.01）。

平板克隆实验结果（图4B）显示NCshRNA组中细胞集落数为（309.2±10.0）个，CDCA7-shRNA2组为（165.3±7.0）个，CDCA7-shRNA3组为（160.7±6.0）个，提示干扰CDCA7表达后PANC-1细胞的增殖能力明显减弱（P值均＜0.05）。

上述结果提示，干扰CDCA7表达能显著抑制PANC-1细胞的增殖能力。

2.5 干扰CDCA7表达对PANC-1细胞侵袭及迁移能力的影响

细胞划痕愈合实验结果（图5A）显示，在相同的时间内，与NC-shRNA组相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3组PANC-1细胞的迁移距离变短，差异有统计学意义（P值均＜0.05）。

Transwell小室迁移及侵袭检测结果（图5B）显示，NC-shRNA组发生迁移的细胞数为（606±6）个，发生侵袭的细胞数为（417±10）个，CDCA7-shRNA2组发生迁移的细胞数为（346±6）个，发生侵袭的细胞数为（268.5±8.5）个，CDCA7-shRNA3组发生迁移的细胞数为（352±9）个，发生侵袭的细胞数为（275±6）个，与NC-shRNA组相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3组PANC-1细胞的发生迁移和侵袭的细胞数均明显减少（P值均＜0.05）。

Fig.1 The expression of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) in different tumors and normal tissues (A),and the expression of CDCA7 in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues (B) were analyzed by The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA) databases.ACC:Adrenal cortical carcinoma;BLCA:Bladder urothelial carcinoma;BRCA:Breast invasive carcinoma;CESC:Cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma;CHOL:Cholangiocarcinoma;COAD:Colon adenocarcinoma;DLBC:Lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma;ESCA:Esophageal carcinoma;GBM:Glioblastoma multiforme;HNSC:Head and neck squamous cell carcinoma;KICH:Kidney chromophobe;KIRC:Kidney renal clear cell carcinoma;KIRP:Kidney renal papillary cell carcinoma;LAML:Acute myeloid leukemia;LGG:Brain lower grade flioma;LIHC:Liver hepatocellular carcinoma;LUAD:Lung adenocarcinoma;LUSC:Lung squamous cell carcinoma;OV:Ovarian serous cystadenocarcinoma;PAAD:Pancreatic adenocarcinoma;PCPG:Pheochromocytoma and paraganglioma;PRAD:Prostate adenocarcinoma;READ:Rectum adenocarcinoma;SARC:Sarcoma;SKCM:Skin cutaneous melanoma;STAD:Stomach adenocarcinoma;TGCT:Testicular germ cell tumors;THCA:Thyroid carcinoma;THYM:Thymoma;UCEC:Uterine corpus endometrial carcinoma;UCS:Uterine carcinosarcoma;TPM:Transcript per million.图1 采用TCGA数据库分析CDCA7在不同肿瘤（A）及胰腺癌及其癌旁组织（B）中的表达情况

Fig.2 The expression levels of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) mRNA (A) and protein(B) in human normal pancreatic ductal epithelial HPDE cells and pancreatic cancer PANC-1,MIA PaCa-2,SW1990,CFPAC-1,Capan 2 and Bxpc-3 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting,respectively.*P＜0.05, vs HPDE cells (n=3).图2 分别采用实时荧光定量PCR法（A）和蛋白质印迹法（B）检测人正常胰腺导管上皮细胞和胰腺癌细胞中CDCA7 mRNA和蛋白的表达水平

上述结果提示，干扰CDCA7表达后能明显抑制PANC-1细胞的迁移和侵袭能力。

Fig.3 The expression levels of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) mRNA (A) and protein(B) in PANC-1 cells transfected with CDCA7-shRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.Blank:PANC-1 cells were infected with the empty vector lentivirus;NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA1,CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA1,CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,***P＜0.001 (n=3).图3 分别采用实时荧光定量PCR法（A）和蛋白质印迹法（B）检测转入CDCA7-shRNA后对PANC-1细胞中CDCA7 mRNA和蛋白的表达水平的影响

Fig.4 After cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering,the proliferation of PANC-1 cells was detected by CCK-8 (A) and colony formation assay (B),respectively.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,**P＜0.01,vs NC-shRNA (n=3).图4 分别采用CCK-8（A）和平板克隆实验（B）检测干扰CDCA7表达对胰腺癌细胞增殖能力的影响

Fig.5 After cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering,the invasion and migration abilities of PANC-1 cells were detected by wound healing assay (A) and Transwell chamber assay (B).NCshRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,vs NC-shRNA (n=3).图5 分别采用细胞划痕愈合实验（A）和Transwell小室迁移和侵袭实验（B）检测干扰CDCA7表达对胰腺癌PANC-1细胞迁移（A）及侵袭（B）能力的影响

2.6 干扰CDCA7表达后对EMT相关蛋白和细胞周期蛋白表达水平的影响

蛋白质印迹法检测结果（图6）显示：与NC-shRNA组比较，2个CDCA7-shRNA组（CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3）PANC-1细胞中EMT相关蛋白Vimentin和细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的表达水平均明显下调，但E-cadherin蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。

2.7 CDCA7与MCM3存在相互作用

通过STRING和GEPIA数据库进行CDCA7与其他蛋白相关性的分析，结果（图7A和7B）显示，CDCA7与MCM2～7复合物显著相关（P＜0.05），提示CDCA7与MCM蛋白可能存在密切联系。进一步在PANC-1细胞中共转染携带有pFlag-CDCA7和p-MCM3的慢病毒，通过免疫共沉淀实验检测CDCA7与MCM3之间的相互作用情况。免疫共沉淀法检测结果（图7C）显示，CDCA7与MCM3存在相互作用关系；蛋白质印迹法检测结果（图7D）显示，干扰CDCA7表达后MCM3蛋白的表达水平明显下调。

Fig.6 The expression levels of epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related protein Vimentin and E-cadherin proteins,as well as cell cycle protein cyclin D1 and cyclin E1 after cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering were detected by Western blotting.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,vs NC-shRNA (n=3).图6 干扰CDCA7表达后对PANC-1细胞中EMT相关蛋白Vimentin和E-cadherin以及细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1表达水平的影响

Fig.7 The expression correlation between cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) and minichromosome maintenance protein 3 (MCM3) was analyzed by STRING database (A) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) databases (B).The interaction between CDCA7 and MCM3 in PANC-1 cells was detected by coimmunoprecipitation assay (C);The MCM3 protein expression level after (CDCA7) gene interfering was detected by Western blotting.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3;TPM:Transcript per million.图7 CDCA7与MCM3之间的相关性

3 讨论

CDCA7定位于染色体2q31，其突变会导致免疫缺陷-着丝粒不稳定性-面部异常综合征[12]。CDCA7在食管癌[13]、结直肠癌[14]、乳腺癌[10]、肺腺癌[15]等肿瘤中高表达，参与调节肿瘤的增殖、侵袭及迁移过程，且与患者预后密切相关。本研究通过GEPIA数据库分析发现，CDCA7在胰腺癌中高表达。进一步通过实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测发现，与人正常胰腺上皮细胞HPDE相比，CDCA7在部分胰腺癌细胞中高表达，提示CDCA7可能参与了胰腺癌的恶性生物学过程。

有研究报道，CDCA7可通过上调组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2（histone-lysine N-methyltransferase）蛋白的表达水平，促进乳腺癌细胞的侵袭及迁移[10]。当前，有关CDCA7对胰腺癌细胞肿瘤生物学行为的影响尚未有较多报道。因此，本项研究通过利用PANC-1细胞来构建干扰CDCA7表达的稳定细胞株，进一步采用CCK-8法、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室迁移和侵袭实验检测沉默CDCA7表达对PANC-1细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的影响。本研究结果显示，在沉默CDCA7表达后，PANC-1细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显受到抑制。

已有研究结果显示，MCM3是一种DNA复制许可因子，由MCM2～7复合物组；MCM2～7复合物是在真核细胞中DNA复制起始和延伸所必需的复制解旋酶[16]。在DNA复制许可的过程中，MCM通过结合细胞周期的M晚期到G1早期的DNA复制起点，诱发染色质进行DNA复制，通过S期促进蛋白激酶激活，与原点结合的MCM复合物在原点解开双链DNA，募集DNA聚合酶并启动DNA合成[17]。由于MCM在增殖细胞的基因组复制中起着至关重要的作用，MCM功能失调可能导致染色体缺陷，从而诱发肿瘤。MCM蛋白在经历恶性转化的人类癌细胞和癌前细胞中高表达[17]。MCM在DNA复制和细胞周期进程中起着关键作用[18]。本研究进一步通过免疫共沉淀和蛋白质印迹法验证发现，CDCA7和MCM3存在相互作用，沉默CDCA7基因表达后MCM3蛋白的表达水平也随之下调存在，提示二者存在相关性

综上所述，本研究在体外初步验证了沉默CDCA7基因表达后胰腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力受到抑制，并且可能通过与MCM2～7复合物的结合来调控胰腺癌的恶性生物学过程，有望为寻求治疗胰腺癌的新的分子靶点提供思路。然而，CDCA7的具体作用途径及分子生物学机制尚未明确，还要进一步的实验探索来阐明。