一株樟子松-褐环乳牛肝菌菌根辅助细菌的筛选和鉴定

宋小双，邓 勋，遇文婧，闵 凯，周 琦

（1.黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨150040；2.黑龙江省森林草原火灾及病虫害防控重点实验室，哈尔滨150040；3.大庆油田矿区服务事业部，黑龙江 大庆163000）

外生菌根菌在促进植物生长、提高养分吸收和抗逆性方面发挥不可替代的重要作用[1-2]。 外生菌根菌在植物根际不是独立存在的，与菌根际真菌、细菌和放线菌等微生物存在复杂紧密的相互作用[3]，菌根际微生物的存在对菌根-宿主植物共生结构的合成、菌根菌菌丝的生长可产生显著的影响[4]。 其中，菌根辅助细菌（mycorrhiza helper bacteria,MHB）是指可以促进菌根真菌生长、在宿主植物根部定殖形成菌根共生结构，从而促进植物生长的细菌类群[5-6]，目前，主要包括农杆菌属(Agrobacterium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、假单胞菌属(Pseudomonas)[7]、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)以及放线菌链霉菌属(Streptomyces)[8]等。 目前, 研究者对黑松-美味牛肝菌[9-10]、黑松—黄色须腹菌[11]、马尾松-彩色豆马勃[12-13]、杨树-劣味乳菇[14]等菌根辅助细菌都进行了分离筛选研究，筛选的菌根辅助细菌包括蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)等可显著促进菌根菌丝生长和提高菌根合成效率。

樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）是欧洲赤松（P.sylvestris）的地理变种，由于其树高及绿化特征常被用作观赏树种进行种植，此外，其具有耐寒、耐旱、适应性强、生长快等特点，目前是我国“三北防护林工程”和“治沙工程”建设的主要针叶造林树种，在生态建设、环境修复等方面发挥着重要的作用[15-16]。 目前，针叶苗木苗圃生产中普遍面临化学农药过量使用导致的病害发生严重、土壤环境破坏、苗木长势不好等问题[17]，根际益生菌的人工引进可以提高植物抗性、改善根际土壤微生态环境，对于苗木的生长及后续造林成活率均有重要意义[17-18]。 目前，樟子松项目组在褐环乳牛肝菌-樟子松互作研究中积累了丰富的研究成果，褐环乳牛肝菌可提高樟子松耐旱性[19-21]、耐盐性[22]，同时褐环乳牛肝菌与根际益生菌互作可提高樟子松抗病性[23-24]。为提高褐环乳牛肝菌-樟子松菌根合成效率，本研究在前期研究基础上，重点聚焦褐环乳牛肝菌-樟子松菌根辅助细菌的分离筛选，并探讨MHB 及其与外生菌根菌互作对樟子松生长的影响，以期为进一步挖掘樟子松根际益生菌资源，制备复合微生物菌肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试外生菌根菌：褐环乳牛肝菌（Suillus luteus）N94 保存于黑龙江省林业科学院森林微生物实验室，采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基培养。

供试细菌：共筛选的75 株细菌分离自樟子松-褐环乳牛肝菌1 年生菌根苗根际土，菌根苗为课题组人工合成，培养于东北林业大学温室。 供试细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养，保存于黑龙江省林业科学院森林微生物实验室。

樟子松种子：购自辽宁省彰武县章古台辽宁固沙所试验林场。

培养基：马铃薯葡萄糖（PD）培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH 值5.6），营养肉汤培养基（牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH 值7.4），R2A 培养基（蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，葡萄糖0.5g，酵母粉0.5g，水解酪蛋白0.5g，磷酸氢二钾0.3g，丙酮酸钠0.3g，无水硫酸镁0.024g，蒸馏水1000mL，pH 值7.0±0.2）。 上述培养基加入18g 琼脂粉制备成固体培养基。

1.2 细菌菌体与外生菌根真菌干皿对抗试验

细菌菌体悬浊液的制备：将71 株供试细菌活化后，少量接种于装有20mL R2A 液体培养基（100mL 三角瓶）中，28℃180r·min-1振荡培养72h。4℃5000r·min-1离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体2 次后，加入适量无菌生理盐水混匀后即为菌体悬浊液。

改良的干皿对抗法[13]：取灭菌培养皿，用无菌打孔器切取在PDA 培养基培养15d 的褐环乳牛肝菌N94 菌饼（直径10mm、厚度5mm），倒置放在灭菌干培养皿中，每皿放置3 块，在菌饼中央滴加25μL 供试细菌菌体悬浊液，25℃恒温培养。 每隔6d 添加25μL 0.01mol·L-1的葡萄糖溶液，防止菌块干燥。 待菌块生长12～16d 后，借助体式显微镜观测菌饼菌丝生长状况。 以滴加生理盐水的作为对照，每处理设6 个重复。

1.3 细菌胞外代谢产物对外生菌根真菌的促生测定

平板互作试验：细菌活化后，接种于装有20mL R2A 液体培养基中，28℃160r·min-1振荡培养72h，0.22μm细菌过滤器过滤后即为含胞外代谢产物的无菌滤液。 将1mL 以上滤液与9mL PDA 培养基混合倒平板后，接种N94 菌块于培养皿中央，置于恒温培养，25℃，14d 后观测其菌落半径，以无菌水处理作为对照。

液体共培养试验：每50mL PD 液体培养基中加入3 块N94 菌饼（直径10mm，厚度5mm），同时加入5mL 无菌滤液，25℃160r·min-1培养14d，定性滤纸过滤，烘箱中60℃烘至恒质量后称质量，以PD 空白培养液为对照，每处理3 个重复。

1.4 MHB 潜力菌株与外生菌根菌双接种对樟子松生长的影响

樟子松育苗[25]：将供试种子用0.5%高锰酸钾消毒30min，清水冲洗数次后，用灭菌湿纱布包裹保湿，置于25℃人工气候箱中催芽，每天早晚用无菌水各冲洗1 次，直至出芽。 将经催芽的樟子松种子播入含有无菌育苗基质（草炭土、蛭石和河沙按2∶1∶1 的体积比例配制灭菌）的营养钵（直径15cm×高13cm）中，每钵30 颗种子，待幼苗出土后，定苗至每钵10 株，在温室大棚种进行常规管护。

菌剂制备及接种： 将褐环乳牛肝菌N94 菌饼接种到250ml （500mL 三角瓶）PD 培养基中，25℃160r·min-1培养20d 制备成液体菌根菌剂。 按照1%比例（体积比）吸取R2A 种子液接种到200mL（500mL 三角瓶）R2A 液体培养基中，28℃160r·min-1振荡培养72h，调整菌液浓度为1.0×107cfu·mL-1，进行接种试验。

接种试验设计：出苗30d 后进行外生菌根菌和MHB 潜力菌株接种，接种量MHB 菌液15mL·钵-1，外生菌根菌50mL·钵-1，在苗根部附近打孔，缓缓注入菌液。 设定4 个处理：（1）单独接种细菌；（2）单独接种外生菌根菌；（3）复合接种细菌+外生菌根菌；（4）无菌水对照，每个处理10 钵，100 株苗，接种完毕后置于温室中进行常规管护。

生长指标测定：在接种处理3 个月后，取样进行生长指标测定，测量苗高、地径指标。

菌根侵染率测定[26]：每个处理随机抽取5 株松苗，将樟子松苗根系小心取出洗净，并用吸水纸将水吸干，以1cm 为标准在根系上下及周围部位随机取100 个根段， 用解剖镜观察记录形成菌根根段数量， 计算菌根侵染率。 每处理取5 株松苗。

1.5 MHB 菌株鉴定

MHB 细菌形态、生理生化特征：参照《常见细菌系统鉴定手册》[27]和《微生物学实验》[28]的方法进行。

16S rRNA 基因序列分析： 将筛选得到的MHB 细菌接种到种子培养基中，37℃，180r·min-1振荡培养48h后，12000r·min-1离心5min 收集菌体，用细菌基因组DNA 提取试剂盒（天根生化）提取基因组DNA，使用16S rRNA 基因通用引物27F（5’-ACTCCTA CGGGAGGCAG-3’）和1492R（5’-GGCGTCTGTACAAGGCCCGG-3’）对基因组DNA 进行PCR 扩增， 反应体系：2×Taq PCR Mastermix 25μL、10mmol·L-127F primer 1μL、10mmol·L-11492R primer 1μL、DNA 模板1μL，加无菌ddH2O 至反应总体积50μL。PCR 反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30 个循环；72℃5min，4℃保存。 PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用Universal DNA 纯化回收试剂盒（天根生化）进行纯化，纯化产物送南京金瑞斯生物科技公司进行测序，测序结果在NCBI 上进行BlastN 比对， 并将序列提交到GenBank 中获得基因登录号， 将相似率较高模式菌株的16S rRNA 基因序列用MEGA X 软件构建系统发育树，进行菌株分类地位鉴定。

1.6 数据处理

使用WPS 2019 软件进行数据编辑整理，使用SPSS 19.0 软件对试验数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 MHB 潜力菌株对褐环乳牛肝菌的促生效应

采用干皿对抗试验对从樟子松-褐环乳牛肝菌菌根根际土壤中分离获得的71 株细菌进行MHB 潜力细菌初筛，有5 株菌对褐环乳牛肝菌N94 菌丝生长表现出促进作用（表1），同对照CK 相比，N94 菌丝增长率介于8.73%～32.59%，其中MHBZ039 和MHBZ043 菌株处理后，褐环乳牛肝菌N94 菌丝增长率分别为20.11%和18.63%。单因素方差分析表明，不同处理之间存在显著差异（p＜0.05）。经MHBZ039 和MHBZ043 处理的N94 菌丝生长都较CK 浓密（图1），MHBZ039 处理的促生效果较MHBZ043 处理得好。

表1 MHB 潜力菌株对褐环乳牛肝菌（N94）菌丝生长的影响Table 1 The effect of the MHB bacteria suspension on the hapha growth of S.luteus （N94）

图1 MHB 潜力菌株对褐环乳牛肝菌(N94)菌丝生长的影响Figure 1 The effect of the MHB bacteria suspension on the hapha growth of S.luteus（N94）

2.2 MHB 潜力菌株胞外代谢产物对褐环乳牛肝菌生长的影响

菌根辅助细菌通过次生代谢产物的分泌来促进外生菌根菌菌丝生长和菌根合成效率， 初筛获得的5 个MHB 潜力菌株胞外代谢产物对N94 的生长也具有良好的促进作用（表2，图2）。 单因素分析结果表明，不同处理之间存在显著性差异（p＜0.05）。 平板互作结果表明，MHB 潜力菌株发酵液处理的N94 菌落直径较CK 增长率介于20.54%～91.89%，其中，菌株MHBZ039 和MHBZ043 的胞外代谢产物对N94 菌落直径增长率分别为91.89%和85.41%。 在5 个测试菌株中效果最好。 液体共培养结果表明，由于MHB 潜力菌株发酵液的存在，菌丝干重与CK 相比有显著增加，其中，菌株MHBZ039 和MHBZ043 胞外代谢产物对N94 菌丝生物量的增长率分别达到42.11%和25.32%。 综合考虑MHBZ039 和MHBZ043 菌株对N94 生长的影响，可初步将MHBZ039 和MHBZ043 菌株视为具MHB 潜力的菌株。

2.3 MHB 潜力菌株与褐环乳牛肝菌互作对樟子松苗生长的影响

菌株MHBZ039 和MHBZ043 分别与N94 组合设计单接种和双接种樟子松1 年生苗试验，松苗生长3 个月后，与未接种处理CK 相比，无论是单接种（细菌或外生菌根菌）处理还是双接种处理都对樟子松苗的生长起到明显的促进作用，且不同处理间差异显著（p＜0.05）。MHBZ039+N94 和MHBZ043+N94 双接种处理松苗的苗高、地径的增长率比CK 处理分别增加8.42%、40.32%和21.41%、34.86%。MHB 潜力菌株的存在可提高褐环乳牛肝菌与樟子松合成外生菌根菌的效率，MHBZ039+N94 和MHBZ043+N94 双接种处理的菌根侵染率分别为57.77%和56.46%（表3）。

表2 MHB 菌株胞外代谢产物对褐环乳牛肝菌（N94）生长的影响Table 2 Effect of bacterial extracellular metabolites on the growth of S.luteus（N94）

图2 MHB 菌株胞外代谢产物对褐环乳牛肝菌（N94）生长的影响Figure 2 Effect of bacterial extracellular metabolites on the growth of S.luteus （N94）

表3 MHB 潜力菌株与S.luteus (N94)互作对樟子松苗生长的影响Table 3 Effect of MHB strains inoculated with S.luteus (N94) on the growth of pine seedlings

2.4 MHB 菌株分类鉴定

生理生化指标：在牛肉膏蛋白胨培养基上，MHBZ039 生长良好，37℃恒温条件下培养48h 后菌落直径可达2～4mm。 菌株MHBZ039 菌落形态规则圆形，单菌乳白色，落边缘整齐（图3），菌体杆状，好氧，革兰氏染色阴性（图4）。 碳源利用测定中菌株MHBZ039 可利用多种碳源，葡萄糖氧化发酵试验阳性，接触酶试验阳性，淀粉水解阴性，明胶液化阴性，硝酸盐还原阳性，MR 和V-P 测定阳性（表4）。

图3 菌株MHBZ039 菌落形态Figure 3 Colony characteristics of MHBZ039

图4 菌株MHBZ039 菌体显微形态Figure 4 Strain morphology of MHBZ039

表4 MHB 菌株MHBZ039 的生理生化指标Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain MHBZ039

16S rRNA 基因测序分析：通过提取菌株MHBZ039基因组DNA，经过PCR 产物序列测定，菌株MHBZ039的16S rRNA 基因PCR 产物长度为1396bp， 将16S rRNA 基因登录到GenBank 中， 基因登录号分别为MN814017，将与GenBank 中的序列比对同源性高的模式菌株序列信息， 利用MGEA X 软件构建系统进化树（图5），序列分析结果，菌株MHBZ039 与Pseudomonas extremaustralis DSM17835T(KX186942.1)的同源性达到99.75%，在此基础上，结合菌落形态和生理生化指标， 菌株MHBZ039 为适冷假单胞杆菌（P.extremaustralis）。

图5 MHB 菌株MHBZ039 16S rRNA 基因的系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of MHB strain MHBZ039

3 讨论与结论

菌根辅助细菌在外生菌根菌-植物互作中具有重要作用[29]，大量研究证实，MHB 的存在对菌根合成效率和植物生长均表现出明显的促进作用。同时，外生菌根菌与辅助细菌存在协同进化机制[6,30]，MHB 作用机制主要包括：在菌根合成过程中促进菌根菌菌丝生长[31-32]、改善土壤微生态环境，减轻菌根菌逆境胁迫压力[33]、代谢激素促进植物根际发育[34-35]，提高菌根菌与植物根系接触几率等。 因此，要针对不同的外生菌根菌筛选其特异性的菌根辅助细菌。

本研究从樟子松-褐环乳牛肝菌1 年生菌根苗根际土壤中分离筛选菌根辅助细菌（MHB），通过干皿对抗法和胞外代谢产物促生测定筛选从75 株根际细菌中筛选MHB 潜力的菌株，干皿对抗试验中，菌株MHBZ039和MNBZ043 处理后，同对照相比，褐环乳牛肝菌N94 菌丝增长率分别为20.11%和18.63%。干皿对抗试验和胞外代谢产物促生试验是快速筛选菌根辅助细菌的有效方法。盛江梅等[10]在美味牛肝菌-黑松菌根辅助细菌筛选中，菌株HB12 处理的美味牛肝菌菌丝直径同对照相比增长17.41%[10]；在对马尾松菌根辅助细菌筛选中，短芽孢杆菌处理对彩色豆马勃和红绒盖牛肝菌的菌丝增长率分别为48.6%和25.0%[13]。 结果表明，干皿对抗法是筛选菌根辅助细菌的有效手段。 菌根辅助细菌的效果还需要苗木接种试验来进一步验证，本研究的樟子松盆栽试验中，双接种处理褐环乳牛肝菌N94+MHBZ039 和N94+MHBZ043，菌根侵染率分别为57.77%和56.46%，同单接种褐环乳牛肝菌相比， 菌根侵染率分别提高26.79%和23.92%， 辅助细菌的存在可显著提高菌根合成效率。苗高和地径同对照相比分别提高28.42%，40.32%和21.41%，34.86%。其中，MHBZ039 效果好于MHBZ043。辅助细菌既可提高菌根合成效率，也可发挥促生细菌的作用促进植物生长，这与李倩等[13]的研究结论一致。 经生理生化指标和16S rRNA 基因分子鉴定，确定菌株MHBZ039 为适冷假单胞杆菌（P.extremaustralis）。

综上所述，本研究从褐环乳牛肝菌N94-樟子松菌根际筛选得到一株菌根辅助细菌适冷假单胞杆菌（P.extremaustralis）MHBZ039，该菌株对褐环乳牛肝菌N94 菌丝生长和菌根合成效率具有显著的促进作用。 同时，MHBZ039 与褐环乳牛肝菌N94 双接种可促进樟子松1 年生苗的生长，菌根辅助细菌的获得为进一步研究褐环乳牛肝菌-菌根辅助细菌-樟子松三者互作机制打下良好基础。