青贮添加剂对微生物多样性影响的研究进展

辛亚芬 陈晨 曾泰儒 杜昭昌 倪浩然 钟怡豪 谭小平 闫艳红

（四川农业大学草业科技学院，成都 611130）

青贮饲料是在厌氧条件下，通过乳酸菌的发酵作用而得到的一种营养丰富、适口性好、消化率高且能长期贮存的优质饲料。青贮是一个非常复杂的微生物活动和生物化学变化的过程，是饲草非常重要的保存方式之一。青贮饲料的质量既取决于青贮原料附着的微生物群落，也取决于其在发酵过程中的演替［1］。饲草青贮发酵过程中的主要微生物有乳酸菌、乙酸菌、梭菌、酵母菌、霉菌等，其中乳酸菌的数量和活性是影响发酵质量的重要因素。大多牧草自身附着的有活性乳酸菌数量有限［2］，自然发酵时乳酸菌难以成为优势菌种，导致青贮失败。为保证青贮尽快进入乳酸菌主导的发酵阶段，常通过添加乳酸菌的方式来增加青贮饲料中的乳酸菌数量，抑制不良微生物的生长繁殖［3］。青贮添加剂除了传统的乳酸菌制剂等发酵促进剂外，还包括发酵抑制剂、好气性变质抑制剂、营养性添加剂4大类。本文从实际生产应用角度出发，重点从乳酸菌制剂、化学添加剂、酶制剂、营养性添加剂4个方面来讨论添加剂对青贮微生物多样性的调控，进而对青贮品质的影响。

1 乳酸菌制剂

乳酸菌是影响青饲料发酵的主要有益微生物，属于兼性厌氧型、革兰氏阳性的无芽孢细菌，能利用糖分发酵形成以乳酸为主的有机酸，并降低pH［3］，抑制腐败微生物的生长，减少发酵过程中的蛋白水解和干物质损失［4］。根据乳酸菌对葡萄糖的发酵形式，可分为同型乳酸菌和异型乳酸菌两大类。同型乳酸菌是制作青贮饲料最古老和最常见的青贮接种剂，其发酵己糖，几乎只产生乳酸［5］。接种这类乳酸菌后，青贮饲料中的乳酸含量和干物质回收率（DMR）较高，乙酸、丁酸、氨态氮含量和pH较低［6］。异型乳酸菌可增加青贮饲料中的乙酸含量，抑制好氧腐败菌的繁殖，提高青贮饲料的有氧稳定性［7-9］。可见，乳酸菌制剂在牧草青贮料的发酵和贮藏过程中起着关键作用。

1.1 同型乳酸菌制剂

同型乳酸菌制剂主要作用是促进青贮早期发酵，提高发酵效率，快速降低pH，抑制有害微生物的活性，使饲草成功青贮［10］。通常用于促进青贮发酵的同型乳酸菌有Lactobacillus、Streptococcus、Pediococcus等［11-12］。

接种同型乳酸菌对青贮发酵中微生物多样性及丰富度会产生不同影响。Keshri等［1］对小麦的细菌测序数据表明，添加同型乳酸菌青贮90 d后细菌多样性较低，Pantoea、Pseudomonas等有害微生物相对丰度减小，乳酸菌在青贮中占主要优势，通过PICRUSt分析表明，有氧暴露后，添加同型乳酸菌与CK处理之间有7条途径显著不同，乙苯降解、D-丙氨酸代谢、萜类骨架合成和离子通道系统的途径在CK处理中更丰富，而添加同型乳酸菌后，硅氧烷双组分系统中新生霉素生物合成更高，这类抗生素的产生可能会限制细菌群落的繁殖。自选耐高温植物乳杆菌LP694可提高青贮饲料中Lactobacillus plantarum及异型乳酸菌Lactobacillus hammesii、Lactobacillus brevis的相对丰度，生产较多乳酸和乙酸，有效提高青贮饲料品质，且添加同型乳酸菌制剂牛鞭草的发酵效果优于异型乳酸菌制剂［13-14］。Yang等［15］研究结果表明，接种植物乳杆菌降低了细菌的多样性，显著提高乳杆菌相对丰度和乳酸含量，抑制腐败梭菌属和致病性李斯特菌属微生物的生长，延缓了高温高湿条件下苜蓿青贮饲料的腐败，提高了苜蓿青贮饲料的发酵质量。王媛等［16］研究结果表明，添加植物乳杆菌青贮后微生物菌群多样性降低，Garciella属和Weissella属的相对丰度较低，Lactobacillus属的相对丰度较高，表明植物乳杆菌作为青贮添加剂可以改变细菌菌群组成。Garciella是一种厌氧嗜热菌属于Clostridiales门、Clostridia属，存在于青贮环境中将会增加青贮难度［17］。Yan等［14］研究结果表明，西南湿热地区多花黑麦草和玉米秸秆混合青贮时，添加添加自选耐高温植物乳杆菌LP149显著降低了青贮原料中的Carnobacterium、Stenotrophomonas、Vagococcus等 不良微生物丰度，增加乳酸菌属相对丰度，且存在较高丰度的L. hammesii和L. brevis的异型发酵菌株，说明植物乳杆菌的添加可以抑制不良微生物的繁殖，改善湿热地区高水分牧草青贮发酵效果；且较高的青贮温度通常会导致青贮过程中乳酸菌从同型发酵向异型发酵转变，一定程度上可以延缓青贮饲料的有氧腐败。

综上，接种同型乳酸菌可调控青贮环境中微生物多样性，在青贮发酵中普遍观察到较多的乳酸菌种类及较高的相对丰度，迅速降低环境pH，抑制酵母菌、霉菌、梭状芽胞杆菌等微生物的生长繁殖，从而提高青贮的发酵品质，解决青贮原料乳酸菌不足，高温高湿等特殊环境下青贮饲料品质较差的问题。因此，在青贮发酵前期，为了保证快速、有力的发酵，抑制有害微生物的生长，接种同型乳酸菌是提高青贮品质的有效方法。

1.2 异型乳酸菌

异型发酵乳酸菌属于乳杆菌科，分属于Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella属［7］，常见布氏乳杆菌、希氏乳杆菌、短乳杆菌等异型乳酸菌制剂主要应用于青贮发酵研究［18］。异型发酵乳酸菌可以在青贮后期，通过产生高浓度的乙酸来抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生长，提高青贮有氧稳定性［19-20］；此外，一些布氏乳杆菌能够在青贮中产生阿魏酸酯酶，在抗菌和提高纤维的消化率等方面表现出优势［16］，然而，其对青贮饲料的发酵效果表现不一［21-23］。

布氏乳杆菌是专性异型青贮添加剂中的优势菌种，接种异型乳酸菌制剂对青贮发酵中微生物多样性及丰富度有较大影响。Wambacq等［24］研究表明，布氏乳杆菌能有效抑制青贮过程中酵母菌等真菌的生长，改善青贮发酵的有氧稳定性。万江春等［25］研究表明，布氏乳杆菌处理有效抑制了酵母菌的增长速率，且有氧暴露后酵母菌的种类也仅有Zygosaccharomyces bailii、Candida tropicalis、Candida ethanolica和Candida rugosa四类，而Z. bailii可能是引起苏丹草青贮饲料有氧变质的主要酵母菌。Si等［26］研究表明，布氏乳杆菌的添加通过抑制紫花苜蓿原料上附着的Enterobacter ludwigii丰度，降低了蛋白质在青贮过程中的降解，改善了青贮发酵的品质。Pascal等［27］研究了异型乳酸菌接种处理对玉米青贮饲料中微生物群落动态变化的影响，结果表明经布氏乳杆菌处理的青贮饲料细菌丰富度在青贮后下降，但含有较高的乳酸菌多样性，主要是专性异发酵菌种，包括Lactobacillus brevis-和Lactobacillus ingluviei相关的OTUs，有助于乳酸转化为乙酸［28］，而乙酸可以很容易地进入微生物细胞，分解并降低细胞内的pH，并消耗大量能量来维持其生理pH，最终杀死无法适应的微生物，从而提高了青贮饲料的稳定性［28］。虽然布氏乳杆菌在发酵过程中会消耗青贮饲料的营养物质，但对真菌的抑制方面表现出更强的抗性作用，在青贮发酵和动物生产效率方面的优势能够弥补营养物质的损失［29］。添加布氏乳杆菌可改变牧草青贮发酵的微生物多样性及丰富度，显著提高青贮饲料的有氧稳定性。

可见，接种异型乳杆菌可调控青贮环境中微生物多样性，通过将青贮发酵系统中的乳酸转化为乙酸，抑制Z. bailii、C. tropicalis等酵母菌的活性和Pantoea、霉菌等微生物的繁殖，提高青贮饲料有氧稳定性。因此，为了抑制腐败微生物的繁殖生长，解决青贮饲料开窖后的腐败变质问题，接种异型乳酸菌是提高青贮饲料贮藏的有效途径。

同型和异型发酵的乳酸菌以不同的方式调节青贮饲料的发酵，发酵中各种微生物群落演替规律和代谢物也存在很大差异。外源乳酸菌制剂通常对青贮饲料的发酵具有积极作用，了解乳酸菌添加剂种类、微生物演替规律及青贮饲料发酵过程中二者的相互作用，将有助于改进青贮发酵过程，生产高质量的青贮饲料。

2 化学添加剂

化学添加剂也是青贮发酵中常用的添加剂［30］，包括无机酸、有机酸等。添加无机酸（如硫酸、盐酸）可迅速制造酸性环境，杀死不良微生物，促进青贮饲料的有利发酵，但研究表明无机酸对青贮设备腐蚀性大、环境污染严重，且易引起动物体内酸碱度失衡、采食量降低、生产性能下降等不利影响，目前无机酸在青贮中使用较少。有机酸（盐）虽不能直接促进乳酸菌的增殖，但可以有效抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生长繁殖，有效提高青贮的有氧稳定性，降低饲料中营养物质的损失［31-35］。

接种有机酸制剂显著影响微生物菌群动态。Jiang等［36］的研究表明，有机酸处理降低了青贮饲料中微生物多样性，提高了乳酸杆菌的相对丰度，抑制了Klebsiella、Paenibacillus和Enterobacter等微生物的生长，有效提高了玉米青贮饲料的品质。陆永祥等［37］的研究表明，添加甲酸后，青贮饲料中不良微生物如酵母菌数量以及微生物多样性指数降低，有益微生物如乳酸菌数量增加，并且能提高燕麦青贮饲料中乳酸菌的丰度，从而改善青贮饲料的发酵品质。然而，也有报道指出，甲酸可迅速渗透到乳酸菌细胞膜上，破坏其生物活性，导致乳酸菌活性降低，青贮发酵受到抑制，对有益微生物乳酸菌产生不利影响［38］。李晓红等［39］测定了有机酸盐不同复配比对牧草青贮发酵有害菌的抑制效果，结果表明双乙酸钠处理显著抑制了大肠杆菌、青霉菌和酵母菌3种有害菌的生长，苯甲酸钠处理对大肠杆菌和青霉菌的抑制作用较为显著，山梨酸钾处理仅对青霉菌的抑制较为显著，复配使用对有害菌的抑制效果更为显著。双乙酸钠对酵母的抑制更有效，且化学添加剂进行复配使用对减少青贮饲料发酵过程中有害微生物的数量，确保乳酸菌群的优势地位有很大的积极作用，可以有效提高青贮发酵的成功率和青贮品质。

化学添加剂可迅速制造酸性环境，降低青贮饲料的pH，抑制Klebsiella、Paenibacillus和大肠杆菌等有害微生物的生长繁殖，减少营养物质的损失，提高青贮饲料的品质及有氧稳定性。因此，了解有机酸添加剂种类、复配剂量等对牧草青贮的细菌和真菌群落组成影响，有助于解释有机酸制剂如何提高青贮饲料的品质及有氧稳定性。

3 酶制剂

青贮中添加的酶制剂主要是多种细胞壁分解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶及复合酶等，可将原料细胞壁的纤维素和半纤维素分解为能被乳酸菌利用的单糖及双糖，为乳酸菌的繁殖发酵提供充足的底物，有利于抑制腐败菌的滋生，提高青贮品质和饲料的利用率。然而，Lynch等［40］的研究表明，添加酶制剂使得酵母菌数量增加，青贮饲料品质未得到提高。

接种酶制剂对青贮发酵中微生物多样性及丰富度会产生不同影响。纤维素酶和α-半乳糖苷酶联合使用增加了乳酸菌的相对丰度［41］；纤维素酶和木聚糖酶联合使用抑制了酵母菌、霉菌和大肠杆菌的滋生［42］。黄媛等［43］的研究结果表明，在添加糖蜜的基础上添加纤维素酶可增加Enterococcus及Lactobacillus的相对丰度，降低了Weissella的相对丰度，同时减少Proteobacteria的相对丰度，引起微生物群落结构发生变化，提高构树的青贮饲料品质。刘菲菲［44］研究了纤维素酶、木聚糖酶及二者复合酶制剂对酒糟与麦麸混贮微生物菌群的影响，结果表明，Firmicutes和Lactobacillus相对丰度随着青贮时间延长逐渐升高，Proteobacteria相对丰度降低，且纤维素酶和木聚糖酶复配使用青贮效果更优。Firmicutes是革兰氏阳性菌，能降解多种大分子化合物，Proteobacteria包括大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌，会与乳酸菌竞争营养物质并产生生物胺，对混贮发酵品质产生负面影响。可见，添加酶制剂有利于青贮品质的提升，且联合添加酶制剂时对发酵品质的提高作用影响要优于单独添加。尽管酶制剂已经使用了很多年，但直到最近才有关于蛋白酶水解玉米籽粒中淀粉颗粒周围的蛋白质基质以改善淀粉消化率方面的研究［45-46］，这种添加剂可以改善较短青贮时间的高水分玉米淀粉消化率，但在开发添加剂方面仍需进一步研究［7］。

酶制剂通过纤维素的分解对乳酸菌提供充足的发酵底物，抑制霉菌等腐败微生物的繁殖，提高青贮品质，且酶制剂的复配使用对发酵品质的效果更优。因此，建议在纤维含量较高、WSC含量较低的饲草青贮时添加适量的酶制剂促进青贮品质的提升。

4 营养性添加剂

营养性添加剂包括葡萄糖、糖蜜饲料、谷类等［47］，可为乳酸菌提供更多的发酵底物，使乳酸发酵迅速占据主导地位，另外，营养性添加剂中还含有天门冬氨酸和谷氨酸等呈味物质，可在青贮中明显改善发酵品质，已作为一种绿色、安全的发酵促进剂被广泛使用。

营养性添加剂可以改变牧草青贮中的微生物群落结构。Luo等［48］研究了添加糖蜜对苜蓿青贮发酵品质、微生物群落的影响，发现添加糖蜜后Enterococcus和Lactobacillus在苜蓿青贮中占优势地位，梭状芽胞杆菌、酵母菌、霉菌等不良微生物被抑制，且乳酸/乙酸随着糖蜜添加量的增加而显著增加。可见，糖蜜的添加为青贮提供额外的发酵基质，促进青贮发酵系统中有益微生物的主导地位，为青贮饲料的发酵和长期保存提供良好的条件。Wu等［49］研究表明，补糖提高了青贮饲料中Lactobacillus相对丰度，降低Pediococcus相对丰度；糖蜜处理显著提高有益乳酸菌相对丰度，降低Citrobacter和Enterobacter的相对丰度，进而提高了苜蓿青贮发酵品质，且微生物菌群结构的变化为减少脂肪酸的损失提供了思路。由此可见，营养性添加剂通过为青贮外源补充发酵底物，促进乳酸菌等有益菌的快速发酵，降低pH，抑制梭状芽胞杆菌、酵母菌、霉菌等有害微生物，进而提高青贮发酵品质。

5 小结与展望

牧草青贮发酵是多种微生物共同作用的结果，青贮品质与微生物群落结构之间有着错综复杂的关系。乳酸菌制剂主要通过提高乳酸菌的相对丰度，降低pH，抑制好氧微生物的生长，提高青贮品质；化学添加剂通过迅速制造酸性环境，抑制有害微生物的生长繁殖，减少营养物质的损失，提高有氧稳定性；酶制剂和营养性添加剂通过为乳酸菌提供充足的发酵底物，促进乳酸菌等优势菌的快速发酵，降低pH，改善青贮品质。4种青贮添加剂通过调节微生物种类及数量，使乳酸菌等有益微生物占据主导地位，抑制酵母菌、霉菌等微生物的生长繁殖，为青贮发酵品质和牧草长期保存提供条件，同时，还可以满足在多种环境下对青贮品质的提升。

因此，了解饲草表面附着微生物特性是决定是否需要添加剂的重要依据，以此为基础，针对青贮的不同需要，将多种优质菌剂联合使用，充分发挥各自的优势才能全面提升青贮饲料的品质以及牲畜生产性能。在该过程中，通过筛选提高菌剂资源库的多样性、定向研发具有特定功能的优质菌剂，结合现代分子生物技术，进一步揭示微生物群落结构及功能与青贮品质之间的关系，将为青贮系统中完整的微生物群落提供有价值的生物学信息。