固相透明质酸-单精子选择装置在卵胞浆单精子注射术中的应用研究*

方东 董波 林悠悠 宋焱鑫

（河南省洛阳市妇幼保健院生殖医学研究所 洛阳471000）

透明质酸（Hyaluronic-Acid,HA）是人类卵子和透明带黏液基质的主要成分[1]。有学者研究表明，人类精子可产生至少两个能与HA 特异结合的蛋白位点。这种结合位点只存在于成熟后期的精子中，不成熟的精子缺乏HA 受体，不具备与HA 结合的能力[2～5]。在人类辅助生殖技术中，常利用卵胞浆单精子注射术（ICSI）治疗因重度少、弱、畸精子症等引起的不孕症。本研究探讨固相透明质酸-单精子选择装置在卵胞浆单精子注射术中的应用。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2018 年4 月～2020 年1月收治的不孕不育夫妇90 对为研究对象。均行ICSI 治疗，40 对采用固相透明质酸-单精子选择装置进行单精子显微注射术助孕治疗为HA-ICSI 组，50 对采用常规单精子显微注射术助孕治疗为常规ICSI 组。HA-ICSI 组男年龄 21～38 岁，平均（29.63±3.26）岁；女年龄 20～37 岁，平均（28.96±3.41）岁；睾丸体积 26～34 ml，平均（30.26±1.25）ml；睾酮水平354～679 ng/ml，平均（516.53±60.32）ng/ml；获卵数4～12 个，平均（8.26±1.03）个。常规 ICSI 组男年龄20～39 岁，平均（28.95±3.30）岁；女年龄 21～38 岁，平均（28.36±3.12）岁；睾丸体积25～35ml，平均（30.57±1.08）ml；睾酮水平 349～685 ng/ml，平均（521.31±58.74）ng/ml；获卵数 5～13 个，平均（8.45±0.97）个。两组基线资料（男女方年龄、睾丸体积、睾酮水平、获卵数）均衡可比（P＞0.05）。

1.2 入组标准 （1）纳入标准：女方性激素水平正常，且经B 超检查显示卵巢功能正常；男方病理检查结果重度少精、弱精子症；知情本研究并签署知情同意书。（2）排除标准：男方合并睾丸萎缩等先天性疾病；伴性传播疾病；泌尿生殖系统感染；女方合并输卵管积水等致不孕症的疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 收集精子 （1）射出精子。男方禁欲3～7 d，于取精日清洁外阴及双手，手淫法获取精液，留取精液于无菌容器内，放置于37℃水浴箱进行液化。14 ml 锥形管中自下而上依次加入1 ml 浓度为90%、45%的Spermgrad 梯度离心液，最后在最上层加入2 ml 液化的精液，离心 30 min（1 600 r/min），上层精浆去除，留取离心管底部沉淀0.3 ml，加入G-IVF（VitroLife 公司培养液）精子洗涤液3 ml，重悬离心洗涤 1 次，离心 10 min（1 600 r/min），弃上清，再加入2 ml G-IVF 混匀，放入培养箱中备用。（2）附睾精子。对术野进行常规消毒铺巾，采用5 ml 注射器先吸取GMOPS-PLUS 精子洗涤液1 ml，对附睾头部固定后直接穿刺进入，保持负压后退出，于显微镜下（×400）对抽吸出含附睾液的培养液进行精子寻找。对于多次抽吸未发现精子者，改为睾丸穿刺取精。（3）睾丸精子。对术野进行常规消毒铺巾，1%利多卡因局部麻醉。选用12 号针经皮穿刺进入睾丸内，采用50 ml 注射器保持负压后退出，吸出的生精小管移至GMOPS-PLUS 精子洗涤液中，将曲细精管磨碎后倒置显微镜下（×400）进行精子寻找。见活动精子后将标本吸入锥形管，加入3 ml GMOPS-PLUS混匀，室温静止15 min 后将上清吸出，只留下少许曲细精管沉渣。吸出的上清移入14 ml 离心管离心10 min（1 600 r/min），弃上清，沉淀物加入2 ml G-IVF 混匀，放入培养箱中备用。

1.3.2 促排卵方案 采用促卵泡生成素、促性腺激素激动剂、绒毛膜促性腺激素（HCG）、人绝经期促性腺激素长方案超促排卵。促性腺激素应用4 d 后，利用B 超监测卵泡发育情况，发现2 个卵泡直径＞18 mm 时，于当晚9:00 进行HCG 肌肉注射，剂量10 000 IU，36 h 后取卵。取出卵子置于二氧化碳培养箱培养。

1.3.3 ICSI 操作 取卵后4～6 h 利用透明质酸酶消化卵子颗粒细胞，之后放入培养箱培养30 min 后选择见到极体的MⅡ卵进行显微注射。HA-ICSI 组：选用深圳博瑞德公司生产的固相透明质酸-单精子选择装置进行显微注射。首先将HA-ICSI 装置从4℃冰箱中取出平衡至室温。吸取20～30 μl 经步骤1.3.1分离后的精子至HA-ICSI 装置中心小槽内（透明质酸包被区域），使精子悬液尽可能布满小槽，在小槽外区域制作PVP 和GMOPS-PLUS 微滴，之后装置覆盖矿物油。装置加盖后在ICSI 热台反应1～10 min。显微镜下挑选被透明质酸结合的精子。结合精子表现为：精子头部被结合至固相表面难以前向运动，但尾部鞭打剧烈。吸取被透明质酸结合的精子至PVP 液滴制动。选择形态好的已制动精子进行传统ICSI 操作。常规ICSI 组：在普通ICSI 皿中分别制 作 PVP 滴 、 若 干 GMOPS-PLUS 微 滴 、GMOPS-PLUS 长条。将洗涤处理后的精子加入GMOPS-PLUS 长条，用显微注射针吸取活力和形态正常的精子进入PVP 微滴制动，然后挑选成熟的MⅡ卵子进行显微注射。完成显微注射的MⅡ卵子转入G1-PLUS 培养微滴皿，放入三气培养箱中进行培养。注射16～18 h 后查看受精情况，以见到双原核（2 pn）为正常受精。48 h 后查看卵裂情况，48～72 h后选择性移植优质胚胎。注射后第5、6 天观察有无囊胚形成。自取卵日开始进行黄体酮肌肉注射，于胚胎移植后14 d 进行尿常规检查，HCG 阳性者20 d后行B 超检查，宫腔内见孕囊、胎心搏动者诊断为临床妊娠。

1.3.4 胚胎评分 利用形态学评估判断胚胎质量，根据卵裂速度、均匀度以及分裂产生碎片比例等进行评分。其中卵裂速度正常，胞质均匀，无空泡、碎片，卵裂球大小均一为1 级；卵裂速度正常，胞质均匀，无空泡，碎片≤10%，卵裂球均匀或大致均匀为2 级；卵裂速度基本正常，细胞质中有少量空泡，碎片11%～19%，卵裂球均匀或不均匀为3 级；卵裂速度异常，胞质不均，有大量空泡，卵裂球不均匀，且碎片≥20%为4 级。4 级胚胎不具有发育潜能；1～3 级为可移植胚胎；1 级、2 级为优质胚胎。

1.4 观察指标 分析HA-ICSI 组和常规ICSI 组的卵子正常受精率、可用胚胎率、优质胚胎率、囊胚形成率、临床妊娠率。

1.5 统计学分析 采用SPSS22.0 统计学软件分析处理数据，计数资料以率表示，采用χ2检验，计量资料以（）表示，采用t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

HA-ICSI 组卵子正常受精率、可用胚胎率高于常规 ICSI 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HA-ICSI 组与常规ICSI 组的优质胚胎率、囊胚形成率、临床妊娠率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 助孕相关结局[%（例/例）]

3 讨论

有学者研究显示，精子与透明质酸结合能力下降是精子不成熟的一种表现形式。头部是否具有透明质酸受体可作为判断精子是否发育成熟的标志[6]。精子发育成熟需要经历胞质膨出、胞质残余体丢失、质膜重塑、头部形成透明带和透明质酸结合位点（受体）等过程。檀大羡等[7]对精子-透明质酸结合试验（HBA）检测结果与体外授精-胚胎移植术（IVF）受精结局进行了研究，发现HBA 与IVF 受精率呈显著正相关，但与ICSI 受精率无关。有学者发现和HA 结合的精子数目与IVF 受精率相关，但不能预测IVF 结局[8～9]。但该受体的存在与精子的哪些结构成熟度有关? 具有透明质酸受体的精子其授精能力究竟如何?目前关于此方面的研究较少。

本研究通过运用固相透明质酸-单精子选择装置进行HA-ICSI，与常规ICSI 技术进行比较。结果显示，HA-ICSI 组正常受精率、可用胚胎率较常规ICSI 组高，差异有统计学意义。HA-ICSI 组优质胚胎率、囊胚形成率、临床妊娠率与常规ICSI 组比较无显著性差异，提示具有透明质酸受体的成熟精子其授精能力较缺少透明质酸受体的非成熟精子更高。两组优质胚胎率、囊胚形成率、临床妊娠率没有明显差异，表明胚胎后续发育能力和着床能力可能与该受体无关，提示胚胎的发育潜能可能不仅仅取决于精子的成熟度，更与卵母细胞的成熟度相关。但该结论可能与本研究样本量较小有关，期待在该方向后续有更大样本量的研究。综上所述，固相透明质酸-单精子选择装置可通过与具有透明质酸受体的精子结合，从而在进行卵胞浆内单精子显微注射时挑选出具有透明质酸受体的成熟精子，提高单精子显微注射技术的正常受精率和可用胚胎率，对提高ICSI 治疗效率有一定的帮助。