猪粪有机肥中可溶性有机组分对小白菜生长及Cu吸收的影响

黄兴洁，吴 昊，李婉秋，李恋卿，潘根兴

(南京农业大学农业资源与生态环境研究所，江苏 南京 210095)

长期畜禽粪便农用以及以畜禽粪便为原料的有机肥农用已成为我国农田土壤重金属的重要来源[1]。有机肥中含有大量可溶性有机质(dissolved organic matter，DOM)，作为有机质中最活跃的组成部分，丰富的官能团结构使其具有很强的表面络合能力，其与重金属络合或螯合后可改变土壤中金属离子的行为和有效性[2]。曾希柏等[3]的盆栽试验结果表明，土壤中有效Cu含量及小油菜植株Cu含量均呈现随DOM添加量增加而增加的趋势。而HU等[4]的批量平衡试验结果显示当平衡溶液中ρ(Cu2+)低于2.81 mg·L-1时，从玉米秸秆中提取的新鲜DOM可促进黄壤对Cu的吸附，而新鲜DOM在好氧条件下培养30 d后却对Cu的吸附显示出抑制效应。这种变化可能是因为DOM是由较高分子质量的胡敏酸、富里酸以及低分子质量的蛋白质、有机酸、糖类和其他化合物组成的有机混合物[5]，不同的组分、官能团种类和数量以及分子质量组成等均会对其络合或螯合效应产生影响[6]。DOM分子质量是控制重金属生物有效性、毒性和转运的重要因素之一。研究表明，在水生生态系统中，高分子质量DOM比低分子质量DOM更能降低Cu对大水蚤的毒性[7]。但关于不同分子质量DOM对植物生长和重金属吸收影响的研究还较少。

笔者采用平衡透析法将猪粪中提取的DOM分离为不同分子质量组分，通过砂培试验研究不同分子质量和浓度梯度DOM对小白菜生长及Cu吸收的影响，以期为有机肥还田的环境风险评估提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试猪粪采自山西省岢岚县集约化养殖场，在猪粪中按照猪粪与秸秆干重比为10∶1的比例添加小麦秸秆后堆肥腐熟1个月，风干、磨细后过2 mm孔径筛备用。石英砂用w=2%的稀HNO3浸泡24 h，用自来水反复冲洗以洗净残酸(洗脱溶液pH呈中性)，再用去离子水洗2～3次，风干备用。

1.2 DOM的提取与分子质量分组

取部分腐熟的猪粪样品于250 mL塑料瓶中，按m(物料)∶V(水)=1∶10加入超纯水，于25 ℃、200 r·min-1条件下在水平恒温振荡机上振荡16 h，离心30 min(转速为4 500 r·min-1，离心半径为10 cm)，上清液立即用0.45 μm无菌微孔滤膜抽气过滤，将样液存放于4 ℃冰箱中待用，存放时间不超过1周。用TOC仪测得的猪粪有机肥中DOM质量含量为62.06 g·kg-1。

DOM分子质量组分的分离采用平衡透析法[8]，选取截留分子质量为1和14 kDa两种型号生物透析袋。透析前，先将透析袋剪切成能装20 mL溶液的小段，在超纯水中浸泡过夜以去除残留的有机聚合物，并反复清洗供试验用。以500 mL玻璃烧杯作为透析容器，加入400 mL超纯水作为外部溶液，先将截留分子质量为1 kDa的透析袋一端用塑料夹子密封(确保不漏液)，加入20 mL制备好的DOM溶液，再将透析袋的另一端用塑料夹子密封，将装好DOM溶液的透析袋完全浸没在水中，最后用保鲜膜密封烧杯口，防止在试验过程中烧杯内水分蒸发。在恒温4 ℃的黑暗培养箱中进行透析，试验过程中经常用玻璃棒在烧杯中搅拌，20 h后更换一次外部溶液，继续透析20 h，整个透析过程持续40 h。此次透析完成后，透析袋外的溶液即为分子质量小于1 kDa的成分，然后将透析袋内剩余样品转移到截留分子质量为14 kDa的透析袋中进行第2次透析。透析完成后，得到F1(<1 kDa)、F2(1～14 kDa)和F3(>14 kDa)3个分子质量组分的DOM溶液样品，用TOC分析仪测得其质量浓度(以C计)分别为90.48、19.84和56.49 mg·L-1，溶液中ρ(Cu)分别为0.23、0.28和0.17 mg·L-1。

1.3 砂培试验

共设置DOM和DOM-Cu两组溶液处理。DOM处理中包括F1、F2和F3这3个分子质量组分，每个组分设置5、10和20 mg·L-1这3个DOM浓度水平，分别标记为F11、F12、F13，F21、F22、F23以及 F31、F32、F33，并以超纯水作为对照；DOM-Cu处理为F1、F2和F3这3个分子质量组分的DOM在5、10和20 mg·L-1这3个浓度水平下与2.5 mg·L-1CuSO4的混合溶液处理，分别标记为F11、F12、F13，F21、F22、F23以及F31、F32、F33，并以2.5 mg·L-1CuSO4溶液作为对照。采用Cu离子选择电极测定各处理液中Cu络合率[9]，在磁力搅拌下将铜电极和参比电极插入标准Cu溶液体系(10-6～10-2mol·L-1)中，由低浓度到高浓度分别测定平衡电位值，并以电位值对铜离子浓度的负对数作图绘制标准工作曲线。通过标准曲线得出各DOM-Cu处理液相应平衡电位值条件下的离子态Cu浓度，进而计算得到Cu有机络合率。各处理液性质见表1。

盆栽试验在南京农业大学温室内进行，供试小白菜品种为“矮脚黄”，将矮脚黄种子在w=10%的过氧化氢溶液中消毒10 min，然后用超纯水洗净。培养皿中放入一层滤纸，将消毒好的种子均匀放在滤纸上，加少许超纯水，置于25 ℃恒温培养箱中，黑暗条件下催芽48 h。将发芽后种子播种于装有300 g石英砂的60 mm×80 mm的塑料盆中，3～4 d后开始供应pH=5.8的1/4 Hoagland营养液，7 d后改为1/2营养液，Hoagland 营养液各成分浓度(mmol·L-1)为NH4H2PO4，1；KNO3，1.5；Ca(NO3)2·4H2O，1；MgSO4·7H2O，1；H3BO3，0.046；MnCl2·4H2O，0.009；CuSO4·5H2O，0.000 3；ZnSO4·7H2O，0.000 8；(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.000 1；Fe-EDTA，0.044。

表1 不同分子质量DOM含量和Cu络合率

生长15 d后，每盆留下长势相近的小苗8株，开始添加不同处理液，每个处理设置3个重复。为避免DOM添加后快速分解，各处理溶液每周添加2次，每次每盆添加30 mL，持续3周后收获小白菜。在不破坏根系的情况下将收获的小白菜分为根和地上部，先用自来水冲洗多次，再用超纯水冲洗3次，并用根系扫描仪(Epson Expression 10000XL，Japan)测定根长和根尖数。鲜样在105 ℃条件下杀青30 min后，于70 ℃烘箱中烘干至恒重，分别称量小白菜根和地上部干重后粉碎待测。

测定方法：称取适量样品用V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1的混合酸消解完全，待测溶液定容、过滤后用火焰原子吸收分光光谱仪测定(FAAS，北京普析，TAS986)，以灌木枝叶GBW07603(GSV-2)进行质量控制，标准样品回收率在87%～113%之间。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理；采用SPSS 21.0进行单因素方差分析，采用LSD多重比较检验和Duncan氏新复极差法分析不同处理间差异程度。

2 结果与分析

2.1 DOM对小白菜生长的影响

不同分子质量DOM和DOM-Cu对小白菜产量的影响见图1，各处理小白菜地上部分干重在0.43～0.51 g·盆-1之间，DOM和DOM-Cu各处理对小白菜产量无显著影响。从小白菜总根长(图2)来看，DOM处理总根长为85～119 cm，添加不同分子质量、不同浓度DOM处理总根长比超纯水处理显著增加19%～40%，但不同DOM处理间无显著差异；与仅添加CuSO4溶液相比，DOM-Cu处理F12和F23总根长显著增加17%和15%，而其他处理与之差异不显著。在相同分子质量和浓度DOM组中，与DOM处理相比，DOM-Cu处理根长降低4%～15%。

对根尖数的影响与根长类似(图2)，与超纯水处理相比，DOM处理小白菜根尖数均显著增加，且增幅高达45%～91%。与CuSO4溶液处理相比，DOM-Cu处理根尖数减少2%～29%，F21、F22、F31、F32和F33差异达显著水平。在相同分子质量和浓度DOM组中，DOM-Cu处理根尖数比DOM处理显著降低44%～60%。

2.2 DOM对Cu生物有效性的影响

图3显示，与CK相比，DOM各处理小白菜根系Cu含量均表现出不同程度的升高，增幅为0.2%～53%。在添加相同分子质量组分的DOM处理中，高浓度DOM更能促进小白菜根系对Cu的吸收，其中，F1、F2和F3这3个组分在添加浓度为20 mg·L-1时根系w(Cu)分别为157.48、153.40和171.15 mg·kg-1，比CK分别显著提高41%、37%和53%。

小白菜地上部Cu含量低于根系(图3)，F2组分各浓度处理小白菜地上部Cu含量均显著提高，随着DOM浓度的升高，地上部Cu含量较CK分别提高40%、66%和74%。F1组分中，仅F13处理小白菜地上部Cu含量较CK显著提高，且增幅高达89%。F3处理小白菜地上部Cu含量呈现随DOM添加浓度的增加而逐渐降低的趋势，当DOM添加浓度为5 mg·L-1时(F31)，小白菜地上部Cu含量比CK显著提高50%，而F32、F33处理增幅仅分别为13%和2%。

不同处理小白菜植株对Cu的总吸收量见图3。除F11处理外，添加DOM的其余各处理小白菜植株对Cu的总吸收量比CK提高10%～75%。F1和F2组分中，小白菜对Cu的总吸收量随着DOM添加浓度的提高而递增，F13处理较CK显著提高75%，F21、F22和F23较CK分别显著提高34%、41%和66%；而在F3组分中则呈现相反趋势，小白菜对Cu的总吸收量随着DOM添加浓度的提高而递减，但F31和F32仍比CK显著提高45%和33%，而各添加浓度间无显著差异。

2.3 DOM对不同分子质量组分小白菜Cu转运系数的影响

DOM对小白菜Cu转运系数的影响与DOM添加浓度和分子质量有关。图4显示，F13和F23转运系数比对照显著提高36%和46%，F33比对照低26%。从分子质量来看，F1、F2组分表现为促进Cu转运的趋势，而F3组分则表现为抑制Cu的转运。F1处理中，F13转运系数比对照显著提高36%，而F11和F12之间没有显著差异；F2处理中，F22和F23转运系数较CK分别显著提高48%和46%；F3处理转运系数随DOM浓度的增加而降低，与F13、F23相比，F33处理显著抑制Cu的转运。

3 讨论

笔者研究结果表明，不同分子质量DOM处理小白菜根长和根尖数均大于超纯水处理，说明DOM可刺激小白菜根系的生长，这与唐超等[10]关于蚓粪DOM对黑麦草根系生长影响的研究结果类似，可能是因为DOM是由多种可溶性有机物质组成的混合体，其中低分子质量氨基酸可以作为营养物质直接被植物吸收，而有机酸本身就是活性物质，可促进植物生长；而DOM-Cu处理小白菜根长、根尖数比相同分子质量和浓度的DOM处理低，说明植物根系对重金属等环境因子反应非常敏感，许多研究表明植物根系在重金属胁迫下根长、根尖数、根体积和平均根直径等根形态指标受到明显抑制[11]。MARQUES等[12]认为在重金属胁迫下根系生长减缓可能是由于细胞分裂减少，导致根系细胞壁厚度增加。CHEN等[11]将毛竹置于含100 mmol·L-1Cu溶液中发现毛竹根系细胞壁更不规则，更厚，细胞核和线粒体出现扭曲。DOM和DOM-Cu处理小白菜产量没有明显变化，LI等[13]的研究结果也表明将商品有机肥、牛粪和鸡粪中提取的DOM添加到土壤中对小白菜地上部生物量没有显著影响。

笔者研究结果还表明不同分子质量DOM对小白菜根系吸收Cu均表现出促进作用，且高浓度DOM更能促进小白菜根系对Cu的吸收。已有研究报道，添加外源小分子有机酸、DOM和合成螯合剂均可促进植物根系吸收重金属，这可能与有机-重金属复合物的形成增强了介质中重金属的迁移有关[13-14]。于振亚等[15]对不同分子质量DOM与Cu的络合特性的研究结果表明<1 kDa的DOM组分与Cu2+络合的条件稳定常数最大，其络合作用最强。加入不同分子质量DOM后Cu的形态分布结果(表1)与此类似，<1 kDa的DOM组分中73.11%～94.69%的Cu以有机络合态形式存在，而>14 kDa的DOM组分中有机络合态Cu仅占39.48%～60.43%。已有研究结果表明Cu更倾向于与腐殖类物质结合而非类蛋白物质[16]。XU等[17]通过三维荧光-平行因子方法分析湖底沉积物中提取的DOM，发现类腐殖酸和类富里酸荧光基团主要存在于低分子质量DOM中，而类蛋白质荧光基团主要存在于高分子质量DOM中。因此，不同分子质量DOM组分物质组成的差异可能导致其与Cu络合特性的不同。一般情况下，游离态金属离子易于穿过生物膜，认为其是最易被植物吸收的形态，而络合态金属由于分子质量较大、缺乏转运蛋白致使其直接进入植物细胞比较困难[18]。但NIU等[19]研究表明Cu-EDDS( [S, S′]-ethylene diamine disuccinic acid, EDDS)络合物可以通过根皮层运输到中柱，特别是在根尖或侧根区，说明金属络合物有被植物根系直接吸收的可能。笔者研究中高浓度DOM处理均促进小白菜根系对Cu吸收的结果说明DOM-Cu络合物有可能直接被小白菜根系吸收。

从小白菜地上部Cu含量和转运系数来看，1～14 kDa的DOM组分和高浓度<1 kDa的DOM组分促进了Cu从根系向地上部的转运，LI等[13]研究发现DOM增加了小白菜根系中Pb向地上部的转运，且小白菜Pb转运系数与DOM的来源和添加浓度有关。合成螯合剂和小分子质量有机酸方面的研究结果也显示有机配体促进了重金属在植物体内的运移。ALMAROAI等[14]向污染盆栽土壤中添加不同剂量合成螯合剂(EDTA、EDDS和NTA)和小分子质量有机酸(草酸、柠檬酸)，结果显示合成螯合剂和柠檬酸的添加促进了玉米根系中Cu和Cr向地上部的转运；水培条件下添加EDTA、HEDTA和DTPA等螯合剂以及柠檬酸、苹果酸和草酸等有机酸均促进了水稻幼苗根系中Cu和Zn向茎叶的转运[20]。ZHAO等[21]通过水培试验研究发现黑麦草根系和地上部植株中Cu-EDDS结合态含量分别占49%～51%和64%～67%，地上部含量高于根系，这说明EDDS对于Cu从黑麦草根系到地上部的转运起到重要作用。因此，重金属通过与有机物质形成稳定络合物而防止被根细胞固定，可能是外源有机配体可提高重金属向植物地上部转运效率的原因之一。笔者研究结果还显示与不添加DOM的对照相比，>14 kDa的DOM组分对小白菜Cu转运没有显著影响，并且转运系数呈现随DOM添加浓度的增大而降低的趋势，说明>14 kDa的DOM组分抑制了小白菜根系中Cu的转运，这可能与不同分子质量DOM的组成、性质以及其与Cu的络合特性不同有关，这方面的机制有待进一步研究。

4 结论

(1)不同分子质量的猪粪DOM均增加了小白菜根系的总根长和根尖数，但对小白菜产量无显著影响；在添加相同分子质量和浓度的DOM组中，DOM-Cu处理小白菜总根长和根尖数均低于DOM处理。

(2)F1、F2和F3这3个组分DOM均促进小白菜根系对Cu的吸收，且添加浓度为20 mg·L-1时的促进作用最明显。对小白菜地上部Cu含量的影响中，F2和F3组分呈现相反趋势，小白菜地上部Cu含量随着F2组分添加浓度的升高而增加，而随F3组分添加浓度的增加而降低，F1组分中仅F13显著促进小白菜地上部Cu含量。

(3)<1和1～14 kDa猪粪DOM组分可促进小白菜中Cu从根部向地上部的转运，而>14 kDa的猪粪DOM组分则抑制Cu从根部向地上部的转运，转运系数随着DOM浓度的增加而降低。