马钱子治疗骨关节炎的潜在药物靶标*

张海燕 武志佳 王延之 曹纪辉 赵昱东 朱明双，

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.成都第一骨科医院康复科，四川 成都 610000；3.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是以关节疼痛、压痛以及关节活动障碍等为主要临床表现的退行性疾病,而关节疼痛及压痛是OA最常见的临床表现，故骨关节炎的治疗常以缓解疼痛为目的[1-3]。马钱子虽有大毒，但马钱子及马钱子复方制剂已广泛用于各种疼痛治疗[4-6]。有研究[6-9]发现，马钱子可用于治疗骨折肿痛、关节炎、风湿痹痛、腰腿痛等骨伤科疾病，且有显著的镇痛抗炎作用，这提示马钱子治疗OA的巨大潜力。网络药理学作为一门整合了分子生物学、计算机与大数据的新兴学科，为研究中药防治疾病的潜在靶标研究提供了新思路和方法。故本文将运用网络药理学分析马钱子治疗骨关节炎的潜在靶标，以期马钱子更好地服务于临床。

1 资料与方法

1.1 主要数据库

1.1.1 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP) 该数据库提供了中药的化学成分较全面的人体吸收、分布、代谢(ADME)性质评价数据。而且还提供了潜在活性成分的靶标及其疾病信息。

1.1.2 GeneCards数据库 该数据库是一个人类基因在线的综合性数据库，它自动整合约125个网络来源的基因的数据，提供了简明的基因、蛋白组、转录、遗传和功能上所有已知和预测的人类基因。

1.1.3 在线人类孟德尔遗传数据库(On line Mendelian Inheritance in Man,OMIM) 这是一个关于人类基因和遗传疾病的综合性数据库，是具有全面性、及时性、权威性和实用性公认的高效信息平台[10]。

1.2 主要软件 Cytoscape3.7.2,Perl软件(V5.30.1)，R语言软件(V3.6.2)

1.3 方法

1.3.1 检索及筛选马钱子及其主要成分 检索TCMSP数据库得到马钱子所有已知成分共62种，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug-likeness,DL)作为马钱子化学成分的筛选条件，即OB≥30%，DL≥0.18为条件检索TCMSP数据库，筛选出符合条件的中药活性成分，共检索到13个化学成分。

1.3.2 筛选出马钱子主要活性成分相关的作用靶基因 应用TCMSP数据库，并运用R语言和Perl软件筛选出符合1.3.1条件马钱子活性成分的靶基因，共计115个。利用Uniprot数据库，查询靶基因与相对应的Symbol，未有相对应的则删除，获得91个靶基因。

1.3.3 构建OA疾病相关靶基因基因数据库 以“ostoarthritis”为关键词，检索GeneCards、OMIM数据库，得到与人类OA相关的靶基因。其中GeneCards数据库检索获得2831个靶基因，OMIM数据库获得27个靶基因。

1.3.4 构建药物-疾病交集图(Venny图) 删除GeneCards、OMIM数据库获得的重复靶基因，得到OA疾病相关靶基因2858个，并删除重复的药物相关靶基因，获得马钱子相关靶基因44个，获得二者交集的靶基因17个，构建药物-疾病的venn图，并应用Cytoscape3.7.2软件对结果进行可视化处理。

1.3.5 构建中药-疾病相互关系网络 构建中药-活性成分-靶基因-疾病相互关系网络即network，运用Cytoscape3.7软件，将network可视化。

1.3.6 PPI网络构建及关键蛋白筛选 将2.5获得的中药-疾病靶点基因的交集运用String数据库构建蛋白相互作用网络(PPI)，分析靶点基因相互关系。相互作用评分设置为“medium confidence(0.40)”，并隐藏游离点，得到靶点基因之间相互关系的PPI网络。然后对PPI网络进行拓扑分析，获取关键靶蛋白10个。

1.3.7 GO功能和KEGG通路富集分析 将1.3.4获得的中药-疾病的17个靶基因进行基因GO(gene ontology,GO)功能和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析，进一步挖掘马钱子防治OA的潜在靶标。

2 结果

2.1 马钱子主要有效成分 马钱子主要活性成分筛选结果根据OB%和DL筛选出13个符合条件的有效成分，见表1。

表1 马钱子主要有效成分Table 1 Main active components of nux vomica

2.2 构建药物-疾病靶点基因交集venn和PPI结果

2.2.1 药物-疾病相关靶点基因共17个(表2)，并将结果运用Cytoscape3.7软件可视化(图1)。这17个靶基因可能是马钱子治疗OA关键靶基因，查阅文献发现主要与核受体家族转录因子密切相关，同时也涉抗炎和镇痛相关的靶基因。

表2 马钱子治疗OA关键靶点Table 2 The key target of The treatment of OA by nux vomica

图1 药物-疾病靶点基因交集表Figure 1 Drug-disease target gene intersection table

2.2.2 运用String数据库构建PPI网络，筛选出10个符合1.3.6条件的关键蛋白，并构建了柱状图(纵坐标代表蛋白的名称；横坐标代表数目，数目越多代表蛋白居于关键中心)，PPI结果与2.2.1相一致，见图2。

图2 PPI关键蛋白柱状图Figure 2 PPI key protein bar chart

2.3 药物-活性成分-基因-疾病相互关系可视化结果 黄色-疾病(OA)，蓝色-中药马钱子，三角形绿色-活性成分，六边形绿色-靶基因，见图3。

图3 药物-活性成分-基因-疾病Figure 3 Drug-active ingredient-gene-disease

2.4 马钱子治疗OA的潜在靶点分析 GO功能分析结果显示核受体可能是马钱子治疗OA的潜在药物靶标(图4)；KEGG富集分析显示马钱子治疗OA的相关信号通路主要有5条，包括雌激素信号通路、脂肪细胞脂解信号通路等，见图5。

图4 马钱子治疗OA关键靶点GO功能注释(仅显示示前20条)Figure 4 Notes on the function of the key targets in the treatment of OA

图5 马钱子治疗OA关键靶点参与的通路富集气泡图Figure 5 Bubble map of pathway enrichment involving key targets of nux vomica therapy for OA

3 讨论

本研究基于网络药理学并挖掘相关数据库和应用各种软件探讨马钱子治疗骨关节炎的作用机制和潜在药物靶点，结果显示马钱子治疗骨关节炎的关键靶点主要有雌激素受体α(ESR1)、孕酮受体(PGR)、核受体亚家族3C组成员(NR3C1)、雌激素受体β(ESR2)、雄激素受体(AR)等，而这些都是核受体超家族(Nuclear receptor，NR)重要成员。同时，GO功能富集分析也发现马钱子治疗OA的基因功能与核受体家族相关，而这其中类固醇激素受体与马钱子治疗OA的关系最为密切。随着基因组学、蛋白质组学及代谢组学等学科的发展，使研究者对OA的潜在靶点有了新的认识。越来越多证据表明，核受体是治疗OA潜在药物靶标[11-13]。有研究[13]发现，人关节软骨中可以检测到NR的表达，并且OA患者与健康者软骨中的NR表达存在差异。

核受体在配体介导的转录和基因表达调控中起着重要作用，他们与其相应配体(通常是指亲脂小分子)结合诱导了它们作为转录激活因子的功能[14]。目前在人类中已经发现48个NR转录因子，根据其配体可以将其分为类固醇激素受体，非类固醇激素受体，以及其各自的配体尚未被发现的“孤儿”受体[15]。根据网络药理学结果显示类固醇激素受体与马钱子治疗OA的关系最为密切。雌激素核受体ESR1和ESR2作为重要的类固醇激素受体，其广泛分布于人体组织，且在关节软骨、软骨下骨以及软骨细胞亦有表达[16-18]。研究[19]发现，雌激素可以通过与ESR1和ESR2结合来参与骨发育成熟和骨代谢功能。但二者的作用并非一样，研究证实，ESR1主要参与成骨细胞的生长，而ESR2与骨的形成与重吸收密切相关。而且OA患者ESR1基因与骨赘分级密切相关[20-22]。同时有学者在OA患者的滑膜细胞中鉴定出了类固醇激素受体(GR、AR、ERα、ESR2)，研究发现当关节内糖皮质激素注射后，类固醇激素受体(GR、AR、ESR1、ESR2)阳性细胞数量均明显减少[23]。此外，雌激素受体α阳性细胞的减少与疼痛和关节残疾评分的VAS的改善显著相关[24]。

马钱子为马钱科植物马钱的成熟干燥种子，其镇痛作用疗效显著，但马钱子的毒副反应限制了其临床应用，因此临床运用时应严格遵照医嘱。安全用药的关键是掌握适当的炮制方法及控制用量，2015版《中国药典》规定马钱子炮制后以丸散入药效果为佳，成人每日安全用量为0.3～0.6 g。因为马钱子的治疗量和中毒量接近，临床用药时须考虑患者体质、年龄及基础疾病等，同时从小剂量开始逐渐加量，以服药后患者无口舌麻木、肌肉抽搐等症状为宜[7]。虽然随着制药技术的发展，马钱子的新剂型越来越多，但2015版《中国药典》记载马钱子口服药用剂型主要为散剂、片剂、丸剂及胶囊为主，外用主要以膏剂为主[25]。故我们研究了马钱子治疗OA时是基于其口服后在人体吸收、分布代谢。

本研究基于网络药理学发现马钱子治疗OA具有多成分、多途径、多靶点的特点。马钱子治疗OA的关键靶点包括PTGS1、ESR1、PTGS2、PGR、NR3C1、HTR3A、OPRD1、ADRB2、SLC6A4、OPRM1、NOS2、AR、F7、ESR2、PLAU、CAT、HAS2，然后利用各种数据库和软件进行GO功能和KEGG富集分析，发现这些靶点基因涉及到核受体活性(nuclear receptor activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)，同时与雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、调节脂肪细胞中脂肪的信号(Regulation of lipolysis in adipocytes)等有关。此外，我们查阅相关文献并结合网络药理学结果发现马钱子治疗OA的潜在靶点与核受体密切相关，而其中类固醇激素受体与OA最为密切，因此本文在这方面进行了重点阐述。综上，核受体家族某些成员(ESR1、PGR、NR3C1、ESR2)可能是马钱子治疗骨关节炎潜在药物靶标，这为马钱子治疗OA提供了新的研究方向。

4 结论

马钱子治疗OA具有多途径、多成分、多靶点特点，核受体家族可能是马钱子治疗骨关节炎的潜在药物靶标。