老年慢性创面动物模型的建立及研究进展*

徐 烽 樊炜静 张寅峰 严仕梦 柳国斌

(1. 上海中医药大学，上海 200023)(2. 上海中医药大学附属曙光医院，上海 200023)

进入21世纪以来，社会人口老龄化问题逐渐成为全世界关注的社会问题，慢性疾病老年患者数量不断增多，慢性创面也成为现代医学逐渐关注的一个医学问题[1]。数据显示，到2050年我国老年人口(60周岁以上)总人数将达到6亿以上[2-3]。我国的慢性创面患者占外科住院患者的1.5%～3%，其中创伤感染占67.5%、压迫性溃疡占9.2%、静脉性溃疡占6.5%、糖尿病足溃疡占4.9%，其他慢性溃疡占11.9%[4-5]。由于外伤感染所致的慢性创面集中于中青年人群，老年人的慢性创面集中于压力性溃疡、静脉性溃疡以及糖尿病足。由于老年群体身体素质及免疫力偏低，对疾病的耐受度低，因此更加难以愈合，慢性创面疾病，即导致老年患者较年轻人更加痛苦，又给患者家庭增加了重担，同时加重社会医疗负担。因此，为了优化诊疗方式，诸多学者对慢性创面进行研究。但是，由于伦理方面的限制，很多研究不能在人体直接进行，这就需要相关疾病的实验动物模型替代，因此使用相关的实验动物模型，进行实验对探索及优化的诊治方案具有重要意义。目前，已知多种慢性创面动物模型的构建方法，现对老年患者慢性溃疡动物模型和创伤性慢性溃疡动物模型的构建方法进行综述，为建立更优的动物模型提供一定的理论基础。

1 动物模型

可用于制作皮肤溃疡的动物模型种类较多，主要有鼠、兔、猪、牛、狗等，不同动物的组织结构不同、价格不同及存在可操作性的差别，因此不同的溃疡模型所选用的动物模型也不相同。最常用的动物模型包括鼠、猪及兔。王雪玲[6]报道，以上三种动物之间也存在着差异，如鼠和兔的皮肤较为松弛，更接近老年人的皮肤，常用于构建老年慢性创面模型。猪的皮肤紧致，接近中青年人的皮肤[7]。在研究外伤感染所致的皮肤溃疡时，猪是比较适合的选择。另外，选用狗、马、牛等构建皮肤溃疡动物模型的人较少，一方面相对于兔和鼠来说，狗、马、牛等体型较大、操作困难、喂养条件和花费都偏高，而且它们组织结构与人体差异较大，选用为溃疡模型可能会对实验结果造成一定的影响，不够贴近临床。

2 压迫性溃疡模型

压迫性溃疡即俗称的压疮或褥疮，是因压力或压力联合剪切力[8]而导致的局部长期受压迫，造成局部缺氧、缺血和营养不良，最终形成组织的坏死溃疡[9]。这类患者以老年人居多，很多老年人随着年龄的增长，常伴有其他严重基础疾病，有些甚至会导致其躯体运动障碍，加之老年人群肌肉及皮肤松弛，更易萎缩，长期卧床压迫发展为压疮。为了探索长期卧床老年人压迫性溃疡的发病机制，寻求更优化的诊疗方式，全世界的科研工作者们进行了诸多研究，模拟了不同的动物模型，目的是为了获得更贴近临床的压疮模型。陈泽群等[7]选用4头5～6月龄雄性小猪，禁食12 h，在对仔猪进行注射麻醉之后，采用自制可调节螺纹—弹簧压力模具，根据“压力大小/压迫时间”进行分组，结果显示15 kg/2 h和20 kg/2 h两组压疮模型效果最好。这两组模型中受压皮肤出现完全缺氧，从而导致小动脉闭塞，光镜下可以看到，断裂坏死的胶原纤维和脂肪细胞；血管表现为管腔内充血或破裂，表皮与真皮脱离，并在交界处有明显的裂隙，造成永久性不可逆性损伤。20 kg/2 h组的创面中，胶原纤维断裂及坏死程度要明显高于15 kg/2 h组。因此，20 kg的压力，作用2 h来制作小型猪深度压疮模型最为合适。在临床上，压疮的发生与发展是压力、剪切力和摩擦力三者共同作用形成的，剪切力加重组织缺血程度，摩擦力损伤皮肤表面，加速压疮形成[10]；剪切力主要影响深部组织，摩擦力主要作用于表皮组织[11]。由此可见，压力、摩擦力及剪切力这三大因素都在临床压疮形成中占有重要地位。该模型的不足之处只模拟出了压力因素所导致的溃疡面。另外，由于压疮的患者主要集中于老年人，而猪的皮肤紧致，因此保持实验条件不变的情况下，将实验动物换成兔子更加贴近于老年临床患者。在下一步的研究中，不仅可以逐渐加入剪切力和摩擦力两因素，还可以采用兔子制作压疮模型进行横向对比，逐渐完善并趋近于临床的压疮模型。

3 静脉性溃疡模型

目前，我国下肢静脉性溃疡患者占下肢慢性溃疡患者的90%，而下肢慢性溃疡的发病率达到了0.5%～3%[12-13]。美国的老年人下肢静脉溃疡的平均发病率是2.2%，而年轻人发病率是 0.5%[13]。由此可见该病在老年人群体中更应该引起我们的重视和关注。下肢静脉性溃疡的发生是由于长期的静脉功能不全和静脉高压，血液回流受阻，导致局部组织瘀滞性缺氧、营养不良，日久溃破形成溃疡。因此，建立合适的静脉性溃疡动物模型，在临床医学基础研究中十分重要。王茜等[14]通过下肢深静脉血栓模型和局部皮肤缺损模型相结合的方法制备静脉性溃疡模型的方法是：选取大鼠左侧腹股沟内侧的髂—骨静脉1 cm，在近、远心端用动脉夹夹闭此静脉，并且在动脉夹相邻位置用无齿蚊式钳夹闭3 s，之后缝合皮肤。24 h后，将血管夹取出，下肢深静脉血栓模型制备成功。3 d后，在左大腿外侧剪去直径1.5 cm圆形创面的全层皮肤，制作局部皮肤缺损模型，最终制成静脉性溃疡模型。结果显示，模型动物血浆中的D-二聚体含量明显增高，凝血酶生成增多及纤溶酶活性增强。这些都特异性反映出血液凝结状态和纤溶亢进[15-16]。以上结果证明血栓模型是可行的。另外，大鼠后期溃疡面积增大、愈合率降低、电镜下细胞破坏严重及结构疏松、炎细胞明显增多并有纤维结缔组织增生，证明静脉性溃疡模型建立良好。该模型的建立具有创新性，成模率较高，为今后静脉性溃疡的基础研究提供了参考。另外，根据静脉性溃疡的发病机制来看，模拟建立慢性静脉高压模型，并且配合组织损伤，是否也能达成静脉性溃疡动物模型的成功制备。张智辉等[17]通过环缩SD大鼠下腔静脉下段和髂总静脉，建立了合适的慢性静脉高压的动物模型。将大鼠下腔静脉下段进行分离，于外表面平行放置一直径0.25 mm导管管芯，随后1号丝线结扎，抽出管芯，同样方法环缩双侧髂总静脉。结果表明，在同时缩窄髂总静脉和下腔静脉后，大鼠后肢的静脉高压持续了12周以上。回顾以往建立后，肢静脉高压动物模型，一般选择直接结扎股静脉或髂静脉，或制造股动静脉瘘，这些方法构建的模型死亡率高，并且压力上升幅度太大[18]，而同时环缩大鼠下腔静脉和髂总静脉的建模方式更加符合下肢慢性静脉功能不全的病理生理改变。不足的是，该实验过程中，并未出现大鼠下肢水肿或溃疡，并且12周以后压力逐渐下降直到恢复正常。是否可以用该方法进行静脉性溃疡发生前的有关研究，亦或是完善实验方案，人为干预形成溃疡，观察是否符合临床下肢静脉溃疡的病理特点。

总的来说，静脉性溃疡的动物模型建立的研究还是偏少，静脉性溃疡动物模型构建体系尚不成熟，仍需要不断探索新的建模方式，筛选出最合适的静脉性溃疡动物模型，实现模型标准化。

4 糖尿病足模型

糖尿病足作为糖尿病最常见的并发症之一，危害巨大，严重情况下可以致残甚至威胁生命。Zhang等[19]报道显示，全世界每年有910万～2 610万糖尿病患者患有足溃疡，全球患病率高达6.3%，而在我国50岁以上的糖尿病患者后期并发糖尿病足的发病率高达8.1%[20]。相比于正常的创伤，糖尿病足的发病机制复杂。Rathur等[21]、Snyder等[22]及Anderws等[23]研究表明，由于长期的高血糖状态造成神经及外周血管病变，直接引起患者下肢末端感觉缺失、血流不足及营养不良。因此，日久溃破难以愈合。

目前，最常用的糖尿病足动物模型是鼠类模型，少数研究者选用猪[24-25]、兔[26-27]等较大型动物。由于实验动物自发病变形成糖尿病溃疡时间较长，因此研究者们通常使用模拟溃疡病理因素来帮助建模。目前主流的方法有感染性、缺血性和神经性溃疡模型[28]。在制作糖尿病模型时，由于成本问题，大部分实验会选择四氧嘧啶(alloxan，ALX)或者链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导结合高脂饲料饲喂来进行建模，该方法所建立的模型更接近于临床上的2型糖尿病。ALX和STZ作用机制都是破坏胰岛β细胞，造成内分泌紊乱而使血糖升高，形成糖尿病。研究表明，ALX建模的成功率高于STZ，但是ALX的缺点是对动物的肝、肾毒性较大，这也是死亡率偏高的原因，而STZ作用较为缓和，对阻止损害较轻，死亡率也相应地降低[29]。Rakieten等[30]报道,STZ诱导糖尿病根据给药方式的不同其成模效果也有差异，如：小剂量分次给药可以建立类似于人类1型糖尿病的动物模型；采用较大剂量一次性注射给药，可以模拟人类2型糖尿病的速发型糖尿病模型。基于此原因，STZ作为常用诱导实验动物糖尿病的药物。另外直接选购转基因糖尿病小鼠(db/db)，其病变程度高，更有利于研究[31]。由于糖尿病足缺血模型的制作方式和压迫性溃疡以及静脉性溃疡的造模方式类似，在这里不再赘述，主要介绍神经性和感染性模型。

4.1 神经性病变溃疡模型

外周神经病变所导致的糖尿病足溃疡患者局部感知功能缺失及关节变形，足部因过度受压而产生溃疡的程度更高危[32-33]。Jin等[34]选用Wistar大鼠，人工使用STZ诱导产生糖尿病，并保持一个月的高血糖状态，促进神经病变，一个月后分离大鼠右侧坐骨神经，再约一周后，大鼠右后肢自然形成了溃疡。该方法很好地模拟了临床上糖尿病足神经病变的过程，但是这种方法的自发率还是偏低，因此采用神经病变来建模的方式目前还不常用。

4.2 感染性溃疡模型

糖尿病同样会损害患者的免疫系统，导致其免疫低下，比健康者更易受感染。因此，感染性溃疡模型也被研究者们所采用的。根据大部分的糖尿病足伤口感染的是金黄色葡萄球菌，因此通常会选用该菌种作为建模所需的病原菌。Chhibber等[35]选用四氧嘧啶诱导小鼠产生糖尿病，在小鼠足部皮下注射甲氧西林金黄色葡萄球菌悬液，分别于注射后的1、3、5、7、9和12 d处死小鼠，取足部感染组织匀浆稀释液进行细菌培养来证明建模成功。

以上两种建模方式主要目的在研究糖尿病足自发性溃疡，但是如果仅仅为了模拟糖尿病足溃疡的外在状态，目前主要采用的是直接对糖尿病鼠进行皮肤切除或者皮肤烫伤，这种方式只是延迟了伤面的愈合，并不能算严格意义上的慢性难愈创面，并不是适用于糖尿病溃疡的机制研究。

5 展望

慢性创面又称慢性难愈性创面，目前对它没有明确的定义，但一般把由内外因作用下导致创面无法通过正常的愈合过程而痊愈，具有病理性炎症反应表现，最终致使创面经久难愈的称为慢性难愈性创面[36-39]。传统观点认为，慢性创面只是一种疾病并发症。付小兵[40]提出，应该把慢性创面当成一种疾病来看待。该类型的创面老年群体中发生的几率偏大，因而在近些年，国内外很多关注老年病的研究都在不断研究促进慢性创面愈合的治疗方法，包括研发新型敷料、新的创面应用药物、物理疗法等，并且不断深入研究细胞通路领域，以进一步阐明发病机制。这些都离不开基础实验，就需要更加完善的及可重复性高的实验动物模型。复制率高、专一性好且再现性好是一个好的疾病模型应该具备的特点[41]。

任何一种动物模型都不能完全模拟出临床患者疾病的所有表现，只能作为一种间接研究，做到某个发病阶段或某个方面和临床疾病相似，动物模型终究无法代替人体。因此，即使动物实验的最终结果是有效的，也还需要在人体上得到验证。一旦发现与临床疾病不同之处，必须及时分析差异，找出原因，正确评估实验方案。