实验动物遗传质量监测技术研究进展与应用*

杜小燕 霍学云 陈振文

(首都医科大学基础医学院，北京 100069)

实验动物的遗传质量监测是通过科学的方法对近交系动物进行遗传本底的一致性检验和封闭群动物的群体遗传学分析，评价其是否符合品系或群体特征，确保品种、品系动物固有的遗传组成和生物学特性。随着生命科学的发展，实验动物遗传质量检测技术和方法也不断进步，从最初的形态学、染色体技术、蛋白质分子和免疫学技术到分子生物学的基因检测，经历了由粗放到精细、由定性到定量、由繁琐到简便的发展历程。上述发展，不仅显著提高实验动物遗传质量评价的准确性和可靠性，减少工作量和缩短检测周期，而且通过遗传检测技术的提升，确保了实验动物遗传质量的可靠性，对实验动物的分类、品种和品系维系、资源的保存、开发和利用及动物的选种和选育发挥重要作用。

1 实验动物遗传质量监测技术

实验动物遗传质量监测技术是借助能反映该动物或群体遗传本质和特征的遗传标记(genetic marker)评价实验动物遗传质量。遗传标记是生物体中基因型遗传信息易于识别的表现形式，包括可用于遗传分析的基因或序列，也包括由遗传控制的任何表型差异，因此具有可遗传学和可识别性两个特征。

1.1 实验动物遗传监测形态学方法

形态学标记(morphological markers)是以可辨认的外观特征为依据。我国春秋时期伯乐相马和奥地利学者孟德尔的豌豆杂交实验均为形态学遗传标记的先例。用于实验动物遗传监测最常见的一种形态学标记是毛色，如白色或野生色分别代表不同基因型，利用毛色表型分离可以推断近交系的毛色基因的方法称毛色基因测试法。另一种形态学标记是颌骨(mandible)形态测定，该性状与遗传因素密切相关，被认为是比较稳定的数量性状，例如陈哲等[1]报道对小鼠进行测定时，可以在一定的坐标图上测量其下颌骨11个位点的分布，然后进行数据分析。毛色在培育动物的过程中是天然的遗传标记，故而仍在使用；颌骨标记则在新的种系鉴定中非常有价值。然而，可用做遗传监测的形态学标记是有限的，而且有些又易受环境的影响。另外，下颌骨标记需要处死动物和比较繁琐的操作，所以这类遗传标记有一定的局限性。

1.2 细胞遗传学监测技术

细胞遗传学标记是指生物的染色体特征，以起源于20世纪50年代的染色体显带技术为依托[2]。常见的显带技术有Q-带、G-带、C-带、R-带、F-带、Cd-带、N-带、F-带、G-H等。其中G-带在整个分裂间期和分裂期相对稳定，可以用来进行品系鉴定和遗传监测。1978年，Hsu等[3]用6种小鼠染色体带纹分析其亲缘关系。其他实验动物，如鸡、牛、长爪沙鼠等均有进行染色体核型分析的报道。除了显带技术，荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术也可以应用于遗传分析，在鉴定基因修饰动物中应用广泛。

1.3 免疫学标记监测技术

免疫标记(immunogenetic markers)监测技术是指利用动物细胞免疫成分进行遗传检测，主要包括组织相容性抗原(H-2)[4]等。1958年，Snell等[5]发现不同基因型的小鼠之间进行皮肤移植无法成功，由此鉴定出一系列小鼠组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因，并做了大量的工作。Callahan等[6]报道大鼠的种间MHC基因也存在多样性，可进行种的区分。对于近交系小鼠，鉴定MHC基因应用最多的方法是皮肤移植[7]；对于单倍型的实验动物鸡和鸭可以采用PCR扩增的方法进行MHC基因型的检测，并已纳入2021年最新发布的北京市实验动物地方标准[8]。皮肤移植方法在新的实验动物近交系品系鉴定中仍然非常重要，但是该方法使用动物数量多，观察时间长，对手术操作的技术要求较高，因此在日常遗传监测中应用较少。

1.4 生物化学监测技术

生化标记(biochemical markers)分析方法是蛋白水平的检测，可用于近交系的品系鉴定和封闭群群体遗传结构分析，具有检测基因位点明确、方法简便、快速、经济等优点。我们国家在邢瑞昌等[9]科学家的努力下，研究开发大小鼠生化位点方法。在1994、2004及2010版国家标准[10]中推荐实验动物近交系小鼠16个生化位点和大鼠11个生化位点的检测方法。除此之外，还有用于其他实验动物遗传检测的报道，包括实验兔[11]、长爪沙鼠[12]等多种动物。生化标记方法在品系鉴定尤其是大小鼠的鉴定中发挥着非常重要的作用。在国家标准中，对大小鼠常用品系位点的电泳位置都有准确定义，但是生化位点的多态性较低，用于封闭群群体遗传结构分析时计算的杂合度、多态信息含量等遗传参数值均偏低。另外，生化位点方法对技术的要求较高，其操作和结果判断需要具有非常丰富的经验。

1.5 分子生物学监测技术

遗传差异归根结底是基因组DNA的不同，因此检测DNA是最直接可靠的遗传评价。DNA水平的分子遗传标记克服了上述方法的诸多不足，具有结果易判读、准确性高、稳定性强、检测周期短、费用低等优点，并可实现无创采样，因而受到实验动物科技工作者的青睐。

1.5.1限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是第一代DNA水平的分子遗传标记。1980年Wyman等[13]发现了对人基因组DNA酶切可获得RFLP，且符合孟德尔遗传。后来Hayashi等[14]发现大鼠线粒体DNA中也存在RFLP。从此以后，RFLP广泛应用于人类及动物遗传学研究，在种间鉴别中非常有价值，目前仍然广泛应用于动物遗传研究和种的鉴别，如Kovalchuk等[15]报道的用于牛β血红蛋白A/B两个变异体的鉴定等。RPLF操作简单，结果易于判断，但在小鼠近交系间多态性较低，不宜用于小鼠近交品系的遗传质量监测。

1.5.2微卫星(microsatellite，MS)DNA是基因组中重要的一种重复序列，又称短串联重复(short tandem repeat，STR)，由1～6个核苷酸的重复单元组成，几乎存在于所有的有机体和细胞中。STR呈现孟德尔式共显性遗传，其多态性非常丰富，如封闭群小型猪的等位基因数能达到几十个[16]。STR有一定的物种保守性，在种系间也可能有同源性，通过同源扩增(cross amplification)可能筛选到新的实验动物STR基因位点。赵太云等[17]和Du等[18]先后用大鼠或小鼠的微卫星DNA引物成功筛选出了长爪沙鼠的STR基因位点；Liu等[19]用长爪沙鼠的微卫星DNA位点获得了灰仓鼠的11个STR基因位点。作为分子遗传标记，微卫星DNA广泛地应用于物种鉴定、个体识别、亲子鉴定等很多领域。在实验动物遗传监测方面，微卫星DNA也发挥着重要作用。国内最初由陈振文教授带领的团队欧阳兆和等[20]和李瑞生等[21]优化PCR条件，筛选优化小鼠和大鼠微卫星DNA位点并进行应用，之后谢建云等[22]和王洪等[23]报道用微卫星DNA位点对近交系和封闭群小鼠及来源于不同生产单位的BALB/c和C57BL/6J进行了分析。目前已建立微卫星DNA遗传标记监测方法的实验动物还包括豚鼠[24]、裸鼹鼠[25]、比格犬[26]等，最近Zhang等[27]建立了实验用鸡、鸭和鹅的微卫星DNA遗传质量检测方法。2021年发布的北京市实验动物质量地方标准中对实验小型猪、实验狨猴、实验猫、实验雪貂等11种(品系)动物均推荐了微卫星DNA遗传标记的检测方法[8]。微卫星DNA方法简单易行，比较经济，且结果易于判断(可借助多种软件)，因而受到众多实验工作者的认可。

1.5.3单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是20世纪90年代由美国学者Lander提出的第三代DNA遗传标记[28]，突变率为10-9，与微卫星DNA(10-2～10-4)相比遗传稳定性更高。常用的SNP分析方法包括直接测序法、基质辅助激光解析飞行时间质谱分析法等。大小鼠目前已建立较成熟的SNP遗传检测方法，岳秉飞研究团队建立了基于PCR扩增的SNP大小鼠检测方法[29-30]，杜小燕团队用比较多的SNP位点(94个)分别对封闭群和近交系小鼠进行了遗传检测，并比较了近交系品系间的差异和STR、SNP和生化位点检测封闭群小鼠的差异[31-32]。2004年Petkov等[33]报道的Jackson实验室的科学家研究了小鼠SNP，从235个SNP凝炼出28个SNP位点，能够对300多种小鼠品系进行区分[33]。2015年Kazuyuki等[34]从1 361个SNP中开发了100个C57BL/6N特异性位点，成功区分该品系的11个衍生品系(即不同生产商的动物)，也可以区分C57BL/6J及其衍生品系。SNP分布广泛数量庞大，而且适于建立高通量方法，但恰恰由于其数量太多，如何在“浩瀚大海”中找到最适合SNP进行各种实验动物遗传监测，是很大的挑战。

2 实验动物遗传质量监测的思考和展望

实验动物生产和繁殖过程中一直伴随着遗传质量问题，近交系的长期近亲繁殖、同一品系在不同国家、地域或生产单位的长时间隔离繁殖、封闭群动物群体数量过小等均会引起遗传漂变。长期的人工饲养环境和选择压力会引起不可避免的突变，也包括自然突变等。目前实验动物遗传监测越来越倾向于DNA水平的技术方法，应用这些方法时需考虑以下问题。

2.1 遗传检测方法的选择

选择适当的遗传检测方法需要综合考虑技术人员力量、仪器设备条件、经费预算、实验耗时和动物使用量所涉及的伦理要求，并结合所使用方法的特点、准确性、重复性等多个方面，例如选用毛色标记需要技术人员有较好的遗传繁育知识、耗时长、成本高；选用STR、RFLP、SNP等分子标记，不需要处死动物，更符合伦理要求，快速简便，但需要掌握PCR和基因分型技术，配备毛细管凝胶电泳和荧光PCR仪；选用生化位点方法则对提取蛋白、蛋白电泳、染色等技术的要求较高，但获得的多态信息含量较低，并且需要处死动物；在近交系品系鉴定时利用皮肤移植是很准确的方法，但其耗时长且动物用量较大。总之，科研工作人员应根据自身的需求和条件选择适当的遗传检测方法。

2.2 分子遗传标记位点的选择

可供选择的实验动物遗传检测分子标记十分丰富，但是采用哪种方法以及选择哪些位点还没有统一，不同动物的差别也较大。李银银等[31]用微卫星DNA和SNP对封闭群小鼠进行检测时发现，同一个群体，用微卫星DNA标记计算的群体遗传参数远大于SNP和生化位点，其中生化位点由于其多态性信息含量较低，所计算的遗传参数最小。另外，在比格犬遗传检测方法的研究中发现，有些微卫星位点具有群体间的普遍性(general)，有些具有群体的独特性(unique)。在建立遗传检测方法的时候，应该选择“general”的位点还是“unique”的位点，是一个值得思考的问题。

2.3 检测结果的判断

在2010版实验动物遗传质量控制国家标准中，对生化位点检测近交系小鼠的结果判断有很详细的描述，因为每个品系的生化位点特征都很清楚，但是对于STR或SNP数量庞大，定义每个品系的特征性STR或SNP位点并非易事。另外，对24种近交系小鼠进行STR和SNP的检测，发现结果却有所不同，SNP位点呈现品系内单态的比例较低，这进一步说明SNP的精确性或敏感性高于STR。另外，目前在多个地方标准中推荐了微卫星DNA或SNP用于封闭群动物的群体遗传结构分析，但检测结果的判断标准不尽相同，有的采用平均杂合度，有的推荐用卡方检验来判断是否为平衡群体，是否应该将香隆指数等更多遗传参数推荐到结果判断中，需要进一步研究和论证。

2.4 发现遗传变异的处理方式

前已述及，遗传变异在实验动物的生产繁殖中不可避免，同一品系的动物在各生产单位之间由于遗传漂变，出现个别位点的等位基因差异也很正常，例如实验中，用STR检测时发现，Jackson和Taconic来源的BALB/c、C3H和DBA/2分别有2个、1个和3个位点的等位基因型不同(未发表数据)。2015年，根据Kazuyuki等[35]报道，用100个SNP的检测结果也说明，来自不同公司的C57BL/6 N和C57BL/6J的SNP等位基因不同[34]，说明同一品系不同生产厂家的动物是存在一定差异的。

实验动物遗传检测技术不断发展为遗传质量控制提供了新的手段，并促使我们思考以下问题：①快速、无损伤、高通量且准确地评价实验动物遗传质量，是实验动物遗传检测新技术面临的挑战。例如，用多重PCR进行微卫星DNA的基因型分析，开发和研制小鼠等常用实验动物的SNP芯片等，都将是努力的方向；②将鉴别品系转变为鉴定品系。目前研究开发的STR或SNP都能实现越来越精确的品系鉴别，无论是用4个STR位点还是11或100个SNP位点都可以有效区分不同小鼠近交系或不同生产商家的同一品系。但是，如何对每一种(品系)实验动物建立自身特有的位点体系，从而对其进行鉴定，需要全世界相关领域的专家长期不断协作努力，期待这一天早日到来。