棉花幼苗AsA-GSH循环对低温胁迫的响应机制研究

李 进 雷 斌 翟梦华 王 莉 张军高 周小云 梁 晶

(新疆农业科学院核技术生物技术研究所/农业农村部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室/新疆维吾尔自治区原子能农学会,新疆 乌鲁木齐 830091)

棉花(GossypiumhirsutumL.)是新疆维吾尔自治区(以下简称“新疆”)重要的经济作物,也是特色优势作物,2019年种植面积为254.05万hm2,总产为500.20万t,分别占全国棉花种植面积和总产的76.0%和84.9%,在中国棉花产业和农业农村经济中占有举足轻重的地位[1]。新疆棉花规模化发展面临着诸多挑战,尤其是苗期低温冷害和“倒春寒”造成的死苗问题亟待解决[2-4]。因此,探明棉花苗期对低温胁迫响应的生理生化机制,寻求抵御棉花苗期低温危害的技术手段,已成为现阶段新疆棉花高效轻简化栽培研究中不可或缺的部分,对促进新疆棉花产业高质量持续健康发展具有重要的理论和实践意义。

低温胁迫会诱导植物产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),从而引起膜脂过氧化程度增加,造成膜系统损伤,导致植物生理生化代谢紊乱,并严重抑制植物生长发育[5-7]。抗坏血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione,AsA-GSH)循环是植物体内清除ROS的重要途径,其中还原型抗坏血酸(reduced ascorbic acid,AsA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是AsA-GSH循环中重要的抗氧化物质,既可以直接还原ROS,又可以作为酶底物清除ROS[8]。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)是AsA-GSH循环的主要酶系组分,它们与AsA和GSH共同参与植物细胞中抗氧化物质再生和ROS清除[8-10]。已有研究表明,玉米[11]、甘蓝[12]、番茄[13]、黄瓜[14]和杏[15]等可通过调控AsA-GSH循环中抗氧化非酶物质含量和抗氧化酶活性来减轻氧化应激损伤,维持植株幼苗体内的氧化还原平衡。

近年来前人围绕低温胁迫开展了棉花幼苗生长特性[16-17]、光合荧光特性[17-18]、酶活性和渗透调节物质等生理特性[19-21]及基因表达[22-23]方面的研究,但有关棉花幼苗AsA-GSH循环对低温胁迫的响应机制研究较少,同时对根、茎和叶生理代谢的研究更是鲜见。基于此,本研究以新陆早57号为试验材料,通过室内模拟低温试验,探讨4℃低温胁迫下棉花幼苗根、茎和叶AsA-GSH循环中抗氧化物质含量、氧化还原状态和抗氧化酶活性的变化规律,揭示棉花幼苗营养器官对低温胁迫的响应机制,旨在为丰富棉花耐低温机理和高产栽培理论提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试棉花品种为新陆早57号,由新疆农业科学院经济作物研究所提供;供试基质为丹麦品氏基质(PINDSTRUP),购于新疆明珠花卉市场。

1.2 试验设计

试验于2019年2月至10月在农业农村部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室(乌鲁木齐)进行。挑选籽粒饱满的棉花种子,75%酒精浸泡2～3 min,无菌水冲洗2～3次备用。将棉种播于装满基质的育苗营养钵(下底直径×上口直径×高度:6 cm×8.5 cm×10 cm)中,每钵9粒种子,共计48钵。置于光照培养箱中培养(光照强度:50μmol·m-2·s-1,昼/夜:14 h/10 h,温度:28℃/22℃,相对湿度:70%～75%),子叶展平时每钵定苗5株,每天补充适量蒸馏水,长至2叶期舍弃长势较差且不整齐的营养钵,筛选长势较好且整齐一致的幼苗进行4℃/4℃(昼/夜)低温处理,分别在处理0(28℃/22℃)、1(4℃/4℃)和2 d(4℃/4℃)时采集棉花幼苗根、茎和第2片真叶,每个处理重复3次,迅速清洗干净,经液氮速冻后保存于-80℃冰箱中用于生理指标测定。试验期间每个处理其他环境条件及管理措施均一致。

1.3 测定项目与方法

分别准确称取0.1 g各处理根、茎和叶,采用各指标试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)提取组织样品的上清液,置于冰盒内待测[24]。

1.3.1 AsA含量测定 按照AsA测定试剂盒(货号:AsA-1-W)说明书配制空白管和测定管待测液,静置20 min后吸取200μL加入96孔板中,采用SpectraMax®i3x多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司,奥地利)在420 nm波长处测定吸光度值A测和A空。根据公式计算AsA含量:

式中,W为样本质量,g。下同。

1.3.2 氧化型抗坏血酸(dehydroascorbate,DHA)含量测定 按照DHA测定试剂盒(货号:DHA-1-W)说明书配制空白管和测定管待测液,迅速混匀后在265 nm波长处测定反应10和130 s时的吸光度值A空1、A空2和A测1、A测2。根据公式计算DHA含量:

1.3.3 GSH含量测定 按照GSH测定试剂盒(货号:GSH-1-W)说明书配制空白管和测定管待测液。混匀静置2 min后于412 nm波长处测定吸光度值A空和A测。根据公式计算GSH含量:

1.3.4 GSSG含量测定 按照氧化型合胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)测定试剂盒(货号:GSSG-1-W)说明书配制待测混合液。于96孔板迅速混匀后于412 nm波长处测定反应30和150 s时的吸光度值A1和A2。根据公式计算GSSG含量:

1.3.5 蛋白质质量浓度测定 按照蛋白质(protein concentration,Cpr)测定试剂盒(货号:BCAP-1-W)说明书配制空白管、标准管和测定管待测液,60℃保温30 min后加入96孔板于562 nm波长处测定吸光度值,分别记为A空、A标和A测。根据公式计算Cpr浓度:

1.3.6 APX活性测定 按照APX测定试剂盒(货号:APX-1-W)说明书配制待测液,迅速混匀后于290 nm波长处测定反应10和130 s时的吸光度值A1和A2。根据公式计算APX活性:

式中,Cpr为上清液蛋白质质量浓度,mg·mL-1。下同。

1.3.7 MDHAR活性测定 按照MDHAR测定试剂盒(货号:MDHAR-1-W)说明书配制待测液,迅速混匀后于340 nm波长处测定反应30和150 s时的吸光度值A1和A2。根据公式计算MDHAR活性:

1.3.8 DHAR活性测定 按照DHAR测定试剂盒(货号:DHAR-1-W)说明书配制待测液,迅速混匀后于265 nm波长处测定反应30和150 s时的吸光度值A1和A2。根据公式计算DHAR活性:

1.3.9 GPX活性测定 按照GPX测定试剂盒(货号:GPX-1-W)说明书配制空白管和测定管待测液,迅速混匀后于340 nm波长处测定反应10和190 s时的吸光度值A空1、A空2和A测1、A测2。根据公式计算GPX活性:

1.3.10 GR活性测定 按照GR测定试剂盒(货号:GR-1-W)说明书配制空白管和测定管待测液,迅速混匀后于340 nm波长处测定反应10和190 s时的吸光度值A空1、A空2和A测1、A测2。根据公式计算GR活性:

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据计算,采用GraphPad Prism 7.0绘图,采用SPSS Statistics 25.0进行方差分析(P＜0.05),并采用Duncan氏法进行多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对棉花幼苗营养器官内抗坏血酸含量及代谢酶活性的影响

2.1.1 AsA、DHA含量及AsA/DHA比率的变化 由图1-A可知,棉花幼苗根、茎和叶中AsA含量均随着低温胁迫时间的延长呈上升趋势。与0 d相比,棉花幼苗根中AsA含量在低温胁迫1 d时无显著差异,至低温胁迫2 d时显著增加,较0 d增加14.13%;棉花幼苗茎和叶中AsA含量在低温胁迫1 d时均显著增加,且低温胁迫2 d时AsA含量显著高于低温胁迫1 d,其中与0 d相比,低温胁迫1和2 d茎中AsA含量分别增加33.33%和110.56%,叶中AsA含量则分别增加56.75%和128.53%。棉花幼苗根中AsA含量整体低于茎和叶。说明棉花幼苗根、茎和叶可通过产生较多的AsA来清除组织中过多的ROS,以减轻低温对棉花幼苗造成的伤害。

由图1-B可知,与0 d相比,棉花幼苗根中DHA含量在低温胁迫1 d时显著降低,但低温胁迫2 d时显著增加,较0 d增加16.00%;棉花幼苗茎中DHA含量在低温胁迫过程中呈先下降后上升的趋势,且低温胁迫2 d时DHA含量较低温胁迫1 d时显著增加,但均低于低温胁迫0 d时的DHA含量,分别低35.34%和12.93%;棉花幼苗叶中DHA含量在低温胁迫1 d时无显著差异,低温胁迫2 d时显著增加,较0 d增加51.31%。棉花幼苗叶中DHA含量明显高于根和茎。

由图1-C可知,与0 d相比,棉花幼苗根中抗坏血酸氧化还原状态(AsA/DHA比率)在低温胁迫过程中表现为先升高后下降,但均与0 d无显著差异;棉花幼苗茎中AsA/DHA比率在低温胁迫过程中显著升高,低温胁迫1和2 d时分别较0 d增加105.47%和141.80%;棉花幼苗叶中AsA/DHA比率在低温胁迫1和2 d时均显著增加,但低温胁迫2 d时与低温胁迫1 d时无显著差异。低温胁迫显著增加了棉花幼苗茎和叶中AsA/DHA比率,根中AsA/DHA比率变化幅度较小且最终降低。说明低温胁迫可通过增加茎和叶中AsA/DHA比率来抵御低温胁迫,叶片氧化还原状态最强烈,且低温胁迫对棉花幼苗根影响较大。

2.1.2 APX、MDHAR和DHAR活性的变化 由图2-A可知,随着低温胁迫时间的延长,棉花幼苗根中APX活性总体呈下降趋势,而茎和叶中APX活性呈上升趋势。与0 d相比,低温胁迫1和2 d时棉花幼苗根中APX活性分别降低16.77%和9.98%,而茎和叶中APX活性分别提高1.61%和11.25%(茎)、3.61%和13.06%(叶)。说明棉花幼苗茎和叶可以通过提高APX活性来清除ROS,从而减轻低温胁迫对其造成的伤害,低温胁迫对棉花幼苗根的伤害程度大于茎和叶。

由图2-B可知,随着低温胁迫时间的延长,棉花幼苗根、茎和叶中MDHAR活性均呈上升趋势,与0 d相比,低温胁迫1和2 d时分别提高49.68%和88.37%(根)、16.78%和45.67%(茎)、44.78%和59.72%(叶)。说明棉花幼苗根、茎和叶可通过提高MDHAR活性来催化产生AsA,增加ROS清除能力,以减轻低温对棉花幼苗的伤害。

由图2-C可知,与0 d相比,低温胁迫1 d时棉花幼苗根和叶中DHAR活性显著升高,分别增加12.09%和13.76%,低温胁迫2 d时均与0 d无显著差异;随着低温胁迫时间的延长棉花幼苗茎中DHAR活性逐渐升高,低温胁迫1和2 d时分别较0 d提高13.93%和21.50%。说明棉花幼苗根、茎和叶可通过调控DHAR活性,使AsA和GSH含量维持在较高水平以适应低温胁迫。

2.2 低温胁迫对棉花幼苗营养器官内谷胱甘肽含量及代谢酶活性的影响

2.2.1 GSH、GSSG含量及GSH/GSSG比率的变化由图3-A可知,随着低温胁迫时间的延长,低温胁迫1和2 d时棉花幼苗根中GSH含量分别较0 d降低14.12%和9.68%,但差异不显著;棉花幼苗茎和叶中GSH含量则呈上升趋势,其中低温胁迫1和2 d时叶中GSH含量分别较0 d显著增加6.08%和16.60%,低温胁迫2 d时茎中GSH含量较0 d显著增加28.96%。综上,低温胁迫减少了棉花幼苗根中GSH含量,增加了茎和叶中GSH含量,且叶中GSH含量整体高于根和茎。说明棉花幼苗茎和叶可通过增加GSH含量来保持细胞膜的稳定性,以减轻低温对棉花幼苗造成的伤害。

由图3-B可知,与0 d相比,棉花幼苗根中GSSG含量在低温胁迫1和2 d时分别增加33.79%和15.93%,且低温胁迫1 d时与0 d差异达显著水平;棉花幼苗茎中GSSG含量则随着低温胁迫时间的延长呈先降低后升高的趋势,其中,低温胁迫1 d时较0 d显著降低11.81%,低温胁迫2 d时较0 d显著增加10.32%;随着低温胁迫时间的延长,棉花幼苗叶中GSSG含量无显著差异。总体而言,低温胁迫增加了根和茎中GSSG含量,且茎中GSSG含量整体高于根和叶。说明低温胁迫对棉花幼苗根、茎和叶产生不同程度影响,低温胁迫对叶的伤害程度小于根和茎。

由图3-C可知,与0 d相比,低温胁迫1和2 d时棉花幼苗根中谷胱甘肽氧化还原状态(GSH/GSSG比率)显著下降,分别降低35.53%和21.75%;棉花幼苗茎中GSH/GSSG比率在低温胁迫过程中无显著差异;棉花幼苗叶中GSH/GSSG比率在低温胁迫1 d时无显著差异,但在低温胁迫2 d时显著增加17.50%。总体而言,低温胁迫降低了根中GSH/GSSG比率,增加了叶中GSH/GSSG比率,对茎中GSH/GSSG比率无明显影响,进一步说明低温胁迫主要对棉花幼苗根造成伤害,对棉花幼苗茎影响较小,推测棉花幼苗叶可通过诱导和调控DHAR、GPX及GR活性来维持GSH含量在较高水平。

2.2.2 GPX和GR活性的变化 由图4-A可知,随着低温胁迫时间的延长,棉花幼苗根、茎和叶中GPX活性无显著差异,但低温胁迫2 d分别较0 d提高2.58%、3.99%和7.53%。说明棉花幼苗营养器官GPX活性始终在正常水平状态下催化GSH与ROS反应,但抑制GPX活性持续升高以减少GSH消耗,从而维持GSH库,保持细胞膜的稳定性。

由图4-B可知,与0 d相比,低温胁迫1和2 d时棉花幼苗根、茎和叶中的GR活性均显著升高,其中在低温胁迫1 d时GR活性均达到最高,分别较0 d显著提高56.15%、47.07%和77.26%。低温胁迫2 d时根中GR活性与低温胁迫1 d时无显著差异,但茎和叶中GR活性均较低温胁迫1 d时显著降低。可见,低温胁迫提高了棉花幼苗根、茎和叶中GR活性,而随着低温胁迫时间的延长,GR活性略降低。说明棉花幼苗营养器官可通过提高GR活性来维持或增加GSH含量,以保持膜蛋白结构的稳定性,减轻低温造成的伤害。

3 讨论

正常情况下,植物细胞内自由基产生和清除处于动态平衡状态。低温等逆境胁迫下,植物体内会产生大量ROS,细胞膜脂发生过氧化反应,造成细胞凋亡或坏死,进而引起根、茎和叶生理生化代谢紊乱,体内矿物质吸收和养分运转受阻,最终导致植物生长发育缓慢[5-7]。同时,低温也可以诱发植物建立防御体系,调控组织内抗氧化酶活性和抗氧化非酶物质含量,协同清除组织中的ROS,避免或减轻ROS对细胞造成伤害,维持细胞膜的完整性和稳定性。AsA-GSH循环系统中重要组成酶为APX、DHAR、MDHAR、GPX和GR,抗氧化非酶物质为AsA、DHA、GSH和GSSG,该系统在低温等逆境下清除植物体内ROS方面作用显著[25-27]。

AsA是AsA-GSH循环系统中清除ROS的重要抗氧化非酶物质,可在APX作用下与H2O2反应,H2O2接受以GSH为中介的NADPH电子还原生成H2O,清除H2O2的毒性,并且AsA可被氧化形成MDHA,部分MDHA进一步氧化形成DHA,AsA也可由MDHA和DHA分别在DHAR和MDHAR的催化下再生[28-29]。本研究发现,棉花幼苗根中AsA含量随着低温胁迫时间的延长呈先不变后增加的趋势,且DHA含量呈先下降后上升的趋势,而AsA/DHA比率表现为先升高后显著下降的趋势,其原因可能是根在低温胁迫1 d时APX活性显著降低(较0 d下降16.77%),导致AsA转化水平下降,引起DHA含量显著降低,使得低温胁迫1 d时AsA/DHA比率增大;低温胁迫2 d时APX、MDHAR和DHAR活性升高,使AsA和DHA含量均增加,但DHA含量增幅较大,导致低温胁迫2 d时AsA/DHA比率下降,说明随着低温胁迫时间的延长,棉花幼苗根清除ROS能力逐渐减弱,低温对棉花幼苗根造成的伤害越大,可能是幼苗根中无叶绿体,抗氧化酶活性和抗氧化物质含量整体水平较低导致的[30]。本研究亦发现,棉花幼苗茎中DHA含量随着低温胁迫时间的延长表现为先下降后上升的趋势,而AsA含量和AsA/DHA比率显著增加33.33%～110.56%和105.47%～141.80%,可能是与0 d相比,低温胁迫1 d时DHAR和MDHAR活性升高,造成AsA含量增加,使得DHA含量减少,而低温胁迫2 d时APX、DHAR和MDHAR活性显著升高,引起AsA和DHA含量显著增加,但DHA含量仍未达到0 d水平,最终导致AsA/DHA比率逐渐增大。本试验结果表明,棉花幼苗叶中AsA、DHA含量及AsA/DHA比率均随着低温胁迫时间的延长呈增加趋势,可能是低温胁迫过程中APX、DHAR和MDHAR活性的升高增加了AsA转化和生成速率,但生成速率高于转化速率,同时引起DHA含量增加,导致叶中AsA/DHA比率增大。本研究结果与低温胁迫对水稻[31-32]、油菜[33]和番茄[34]的结果较为相似。

GSH是AsA-GSH循环中重要的抗氧化剂之一,较高的GSH库可维持膜蛋白结构稳定,GPX和DHAR能特异催化GSH生成GSSG;而GR可反向催化GSSG生成GSH,且其活性与细胞GSH库的水平密切相关[35-36]。本研究发现,棉花幼苗根中GSH含量在低温胁迫过程中减少9.68%～14.12%,GSSG含量增加15.93%～33.79%,GSH/GSSG比率显著降低21.75%～35.53%,原因可能是低温胁迫处理下DHAR和GR活性显著升高,且GPX活性维持在较高水平,使GSH含量略有下降,GSSG含量增加,最终引起GSH/GSSG比率下降。本研究还发现,棉花幼苗茎中GSH含量随着低温胁迫时间的延长逐渐增加,而GSSG含量呈先降低后增加的趋势,GSH/GSSG比率无显著差异,其原因可能是低温胁迫1 d时GR活性显著升高及GPX和DHAR活性无显著差异,导致GSH含量增加和GSSG含量减少,而在低温胁迫2 d时GPX活性略微增加,GR和DHAR活性显著高于0 d时,使得GSH和GSSG含量均增加,且增幅较一致,最终导致茎中GSH/GSSG比率升高不明显。本试验表明,棉花幼苗叶中GSH含量随着低温胁迫时间延长显著增加6.08%～16.60%,GSSG含量无显著差异,与0 d相比,GSH/GSSG比率在低温胁迫1 d时无显著差异,但在低温胁迫2 d时显著增加17.50%,可能是因为低温胁迫1和2 d时GR和DHAR活性均升高,使GSH含量增加,而在DHAR和GPX作用下,GSSG含量维持在正常状态,从而导致GSH/GSSG比率升高。本研究结果与低温胁迫对甘蓝[12]、甜樱桃[35]、黄豆[37]和油菜[38]的研究结果较一致。

4 结论

本研究结果表明,低温胁迫可以增加棉花幼苗根、茎或叶中AsA和GSH等抗氧化物质含量,提高AsA/DHA和GSH/GSSG比率,提高或维持APX、DHAR、MDHAR、GPX和GR等抗氧化酶活性,即通过调整AsA-GSH循环系统来清除ROS,以减轻低温伤害,其中低温对棉花幼苗根AsA-GSH循环影响最大。由于低温胁迫会产生大量ROS,而本试验未对低温胁迫下棉花幼苗营养器官中相对电导率、丙二醛含量、过氧化氢含量以及超氧阴离子、羟基自由基及ROS产生速率等ROS代谢关键指标进行研究,下一步应结合这些关键指标与生理指标,探索棉花幼苗耐低温相关机理。