复方中药制剂体外杀纤毛虫及毒性试验研究

秦志华，张林林，郭 沛，荣 榕，张 慧，张乐萃，单 虎

(1.青岛农业大学 动物医学院，山东 青岛 266109； 2.青岛海鑫慧药业有限公司，山东 青岛 266109 )

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)于1992年引入我国，具有生长速度快、易集约化养殖等优点，迅速成为我国山东、辽宁等沿海地区的重要养殖品种[1]。盾纤毛虫主要寄生在大菱鲆鳃部、体表溃疡面、脑部及肠道内，具有发病率高、流行范围广且时间长、易与其他细菌性疾病并发的特点，是大菱鲆养殖过程中最重要的疾病之一[2-4]。在实际生产中，滥用抗生素等药物的情况普遍存在，大菱鲆体内大量的药物残留，严重制约了大菱鲆养殖业的健康发展，同时也导致了严重的食品安全问题，因此研究防治盾纤毛虫病的高效、低毒、低残留、无公害的中草药迫在眉睫[1,5]。我国有广阔的养殖市场以及丰富的中草药资源，拥有得天独厚的条件和悠久的中药研究史，随着科学技术的不断进步，中药治疗大菱鲆的盾纤毛虫病具有广阔的应用前景。笔者旨在筛选合适的中药组合物治疗盾纤毛虫病，同时可有效减少鱼类食品中化学药物的残留，促进绿色环保养殖业的发展，保障人类的健康安全，对发展我国绿色生态水产养殖业具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物

2种盾纤毛虫水滴伪康纤虫(Pseudocohnilemuspersalinus)和海洋尾丝虫(Uronemamarinum)均由中国海洋大学提供；大菱鲆，体质量18～20 g，购自莱州永丰水产养殖有限公司。

1.2 试验药物

复方Ⅰ：十大功劳、黄柏、半枝莲、苦参、百部、槟榔；复方Ⅱ：大黄、黄芩、野菊花、蛇床子、石榴皮、乌梅；复方Ⅲ：地丁、蒲公英、野菊花、地锦草、败酱草、龙胆草、鱼腥草、青蒿；以上中药材均购自安国市北辰中药材有限公司。

1.3 饲养管理

使用循环水箱饲养大菱鲆，试验期间确保氧石正常工作，观察鱼的精神状态和摄食情况。进行驯养试验7 d后开始正式试验，每日7:00和19:00投喂，残饵和排泄物及时清理干净，并做好各项试验记录。

1.4 试验方法与指标检测

1.4.1 中草药的提取及盾纤毛虫液的制备

分别将3个复方中药材浸泡后用水煎煮，获得中药材的水煎煮浓缩液1 g/mL，冷却后4 ℃冷藏备用。

以灭菌过滤海水(0.5 μm孔径以下的过滤器过滤)为培养液，加入煮沸的新鲜大菱鲆鱼肉汁数滴作为饵料，将2种盾纤毛虫分别放入该培养液中进行常温培养2～3 d，所培养的虫体作为试验观察材料。

1.4.2 体外杀虫试验

试验在96孔细胞培养板中进行，调整试验初始各组虫体密度均小于103个/mL，每孔加入90 μL药液和10 μL离心后的虫液，试验共分为7组，每组3个平行，药物剂量分别为0、5、10、15、20、25、30 mg/kg。在显微镜下观察盾纤毛虫的状态，前16 h连续观察，之后每12 h观察1次至48 h，详细记录各组药物发挥作用的时间，以筛选出最佳药物及质量浓度。

1.4.3 大菱鲆毒性试验

利用上述试验筛选出的复方Ⅱ，进行大菱鲆毒性试验。选取体质量相近且健康的大菱鲆144尾，随机分为4组，即空白对照组(0 mg/kg)、推荐剂量组(20 mg/kg)、3倍剂量组(60 mg/kg)、5倍剂量组(100 mg/kg)，每组3个平行，每个平行12尾。每日药浴2次，每次3～4 h，试验期为7 d。试验结束时，鱼尾静脉采集全血和血清，使用血液细胞分析仪和全自动生化分析仪，分别进行血常规和血液生化指标检测。在药浴试验开始时停食24 h，测量大菱鲆体质量和体长，试验结束时停食24 h。

1.4.4 病理切片的制作

试验结束时剖检大菱鲆，取大菱鲆肾脏、肝脏、胃、肠、鳃，立即放入固定液中固定，通过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精—伊红染色等步骤制作石蜡病理切片。

1.5 数据处理

数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan′s法多重比较，结果均以平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 体外杀虫试验

复方Ⅰ的药物剂量在0～30 mg/kg时均对海洋尾丝虫无杀害作用；复方Ⅲ仅在药物剂量为30 mg/kg时对海洋尾丝虫有杀害作用，在其他剂量时无效；复方Ⅱ的药物剂量在10 mg/kg时即发挥药效，随着药物剂量的增加，海洋尾丝虫全部死亡所用的时间越来越短，且在剂量为20 mg/kg时达到最佳效果(表1)。显微镜下观察，水滴伪康纤虫毒性试验结果发现，复方Ⅱ 20、25、30 mg/kg组1 h全部死亡；而其他各试验组在加入药液22 h后，均繁殖出新的幼虫且运动活跃。

表1 中药复方对海洋尾丝虫的影响

复方Ⅰ的药物剂量在0～30 mg/kg时均对水滴伪康纤虫无杀害作用；复方Ⅲ在药物剂量为20 mg/kg时对虫体有杀害作用，且随着药物剂量的增加杀虫效果没有变化；复方Ⅱ的药物剂量在20 mg/kg时即发挥药效，且随着药物质量浓度增加杀虫效果并无变化，药物效果稳定，即在剂量为20 mg/kg时达到最佳效果(表2)。

2.2 大菱鲆毒性试验

2.2.1 复方Ⅱ对大菱鲆血常规指标的影响

白细胞、红细胞、嗜酸性细胞等指标均与对照组差异不显著；但是血红蛋白指标中，20 mg/kg组显著低于空白对照组(P<0.05)；在血小板指标中，20 mg/kg组显著低于100 mg/kg组(P<0.05)(表3)。

表2 中药复方对水滴伪康纤虫的影响

表3 药浴对大菱鲆血常规指标的影响

2.2.2 复方Ⅱ对大菱鲆血液生化指标的影响

甘油三脂、葡萄糖、球蛋白等指标均与对照组差异不显著；但谷草转氨酶指标中，60 mg/kg组显著低于其他3组(P<0.05)。在尿素指标中，20 mg/kg组显著低于其他3组(P<0.05)(表4)。

表4 药浴对大菱鲆血液生化指标的影响

2.2.3 复方Ⅱ对大菱鲆主要脏器病理变化的影响

与空白对照组相比，各试验组大菱鲆的鳃、肠道、胃、肝脏和脾脏均无明显的病理变化(图1～图5)，表明复方Ⅱ对大菱鲆的脏器无毒性。

3 讨 论

纤毛虫营自生生活，属兼性寄生虫，但在一定的环境下，纤毛虫营寄生生活，可吞噬甲壳类、鱼类的细胞和组织残渣，并在其体内寄生生活，其中盾纤毛虫病成为大菱鲆养殖业中常见的寄生虫性疾病[6-7]。引发大菱鲆盾纤毛虫病的盾纤毛虫种类较多，本试验所用的水滴伪康纤虫和海洋尾丝虫，均为严重危害海水养殖鱼类的兼性寄生盾纤毛虫。海洋尾丝虫属盾纤目、尾丝虫属，水滴伪康纤虫属盾纤目、伪康纤虫属，其最适生存温度为20 ℃，寄生在鱼体的表面、血液、心脏等组织器官内，可通过口、鳃、皮肤、腹腔等途径感染大菱鲆，在富营养化水体中极易繁殖，一旦暴发，死亡率超过60%[8-11]。

图1 大菱鲆鳃部组织切片(×400) Tab.1 The pathological section of gill in turbot S. maximus a.空白对照组； b.20 mg/kg； c.60 mg/kg； d.100 mg/kg;标尺=50 μm;下同. a.control group； b.20 mg/kg； c.60 mg/kg； d.100 mg/kg; bar=50 μm; et sequentia.

图2 大菱鲆肠道组织切片(×400) Tab.2 The pathological section of intestine in turbot S. maximus

图3 大菱鲆胃组织切片(×400) Tab.3 The pathological section of stomach in turbot S. maximus

图4 大菱鲆肝脏组织切片(×400) Tab.4 The pathological section of liver in turbot S. maximus

图5 大菱鲆脾脏组织切片(×400) Tab.5 The pathological section of spleen in turbot S. maximus

3.1 中药复方体外杀虫试验

在中药复方筛选试验中，将由3个不同复方制成的药液分别作用于海洋尾丝虫和水滴伪康纤虫，虽然2种盾纤毛虫的结构略有不同，但是在复方Ⅱ的10～60 mg/kg 6个试验组用药后，显微镜下观察，均出现纤毛停止摆动、结构模糊、虫体结构完全被破坏、胞质流出并凝固、死亡的现象，说明复方Ⅱ对2种盾纤毛虫有很好的驱虫效果。而复方Ⅰ、Ⅲ对2种盾纤毛虫均无效，显微镜下观察虫体，发现其结构完整，运动活跃。即使药物剂量提高后，虫体全部被杀死的时间也比复方Ⅱ所用的时间要长。复方Ⅱ的20 mg/kg试验组，海洋尾丝虫和水滴伪康纤虫在用药1 h时全部死亡，达到用药效果的最佳；复方Ⅰ、Ⅲ在低剂量时，几乎无效，即使随着药物剂量的提高，虫体全部死亡所用的时间也会有波动和反复，不具有一般规律性。复方Ⅱ中含有大黄、苦参等中草药。大黄归脾、胃、大肠、肝、心包经，内服外用皆宜；具有调节胃肠功能、清热泻火、解毒、抗炎和抗病原微生物等药理作用。苦参中含有氨基酸类、糖类、甾醇类、生物碱类、黄酮类等成分，在中药中按功效分类属于清热药中的清热燥湿药。有试验证明，苦参对鞭毛虫、阴道滴虫等有一定的抑制效果[12]。倪小毅等[13]通过体外试验证明，青蒿素能使侵入细胞的虫体膜系结构广泛性损伤，造成核膜断裂、线粒体膨胀、空泡样变性、内质网扩张甚至出现核碎裂、核溶解现象。虽然复方Ⅰ、Ⅲ中的中药成分都具有杀菌、抗病毒、增强机体免疫的功效，但是多种中药成分组成的复方药的杀盾纤毛虫效果却不及复方Ⅱ的效果好，这可能与每个机体对药物的耐受能力不同有关，也可能与给药时间、给药次数、配伍禁忌、药动学相互作用等方面有关[14]，具体原因，还需通过试验进一步的探究。

3.2 大菱鲆毒性试验

中草药中富含糖类、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质以及多种必需氨基酸，可以提高消化酶的活力，增强机体消化吸收营养物质的能力，提高大菱鲆的生长速度[15]。血液是动物体内循环系统的重要组成部分，对于维持鱼体内环境的稳定具有重要意义，并且起着物质运输、生理调节及生理防御等重要功能[16]。血液生化指标是动物体内蛋白质、糖类和脂类等物质代谢过程的直接体现，能够反映机体生理和健康状况的变化[17]。同时，各种酶类和激素等水平也可以用来指示机体的免疫、营养、病理和药理等状况，也经常作为考察机体健康程度的重要参考指标，是动物品种选育和养殖监测等工作中的必要辅助措施。本试验结果显示，20 mg/kg组血红蛋白指标显著低于空白对照组(P<0.05)，这可能与每个水循环系统的温度差异有关，但是引起血红蛋白偏低的原因较多，还需要试验更深入的探究。100 mg/kg组谷草转氨酶的数量与其他3组相比，差异显著(P<0.05)，数量低于其他组。谷草转氨酶是动物体内重要的转氨酶，在各个组织中广泛存在，以心肌含量最高，肝脏次之。其数量偏低，提示肝功能有轻微的变化，但是数值在正常的范围内。引起生化指标变化的因素多且复杂，如个体差异、采血时生理状态等因素[18]，往往是几个因素共同作用的结果，还需进行大量的药理试验确定是由哪些因素所致。同时，显微镜下观察大菱鲆的肝脏、肾脏、脾脏、胃、肠和鳃部的组织切片，细胞组织结构正常，未见明显异常现象，这表明复方Ⅱ对于大菱鲆无明显的毒性作用。

4 结 论

试验结果表明，复方Ⅱ能显著地杀灭海洋尾丝虫和水滴伪康纤虫，药物剂量为20 mg/kg时具有良好的驱虫效果；同时通过大菱鲆毒性试验，复方Ⅱ对大菱鲆无明显的毒害作用。

预防大菱鲆盾纤毛虫病不仅需要使用中草药预防治疗，同时需要加强大菱鲆的饲养管理，如降低饲养密度，鱼池及时消毒，鱼饵料和排泄物及时清理，多投喂颗粒料少投喂冰鲜鱼等。做好预防工作，多方面同时管理，提高鱼的生长性能，绿色养殖、科学养殖，将大菱鲆养殖行业带入一个新的发展阶段。