早期运动联合戊四氮对脑缺血再灌注大鼠神经功能的效果及其机制

彭志锋，张义平，张继红

山西大同大学医学院生理系教研室，山西大同市037009

脑卒中是世界范围内导致身体残疾的主要原因之一，严重影响患者生活质量。在中枢神经系统中，神经营养素在神经可塑性、神经发生和神经保护中起重要作用[1]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养素家族的一员，在脑卒中后运动功能恢复中起重要作用[2-3]。有氧运动可增加动物模型大脑皮质、纹状体和海马等脑区BDNF 表达[4-5]。另外，脑卒中也影响γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid,GABA)介导的抑制功能。脑卒中小鼠半影区神经元GABA 介导的肌张力抑制增强，注射GABA 受体拮抗剂可改善脑卒中小鼠的感觉运动功能[6]。本研究探讨早期跑步运动和GABA 受体拮抗剂戊四氮(pentetrazol,PTZ)对缺血再灌注大鼠神经功能和BDNF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Sprague-Dawley 大鼠50 只，体质量240～280 g，购于山西医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(晋)2009-0001。研究过程中对动物处理均按照国家颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》和山西大同大学医学研究伦理委员会要求执行。大鼠平均分为假手术组、模型组、运动组、戊四氮组和综合组，每组10只。

1.2 实验仪器和试剂

ZH-PT 型电动跑步机：安徽正华生物仪器设备有限公司。戊四氮、TTC 染料：美国SIGMA 公司。RNA 提取试剂盒、BDNF ELISA 试剂盒：天根生物科技有限公司。基因特异性引物由上海斯信生物科技有限公司合成。

1.3 模型制备

除假手术组外的大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠60 mg/kg 麻醉。剪毛后颈正中切口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，线栓法行大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。MCAO 后1 h拔出线栓，缝合皮肤。

假手术组同法手术，但不插入线栓。

1.4 干预方法

术前，运动组和综合组跑步机上适应性训练3 d，每天10 min。术后2 d，运动组和综合组跑步机上训练，速度15 m/min，每天30 min，共5 d；术后2 d，戊四氮组和综合组每天腹腔注射戊四氮0.25 mg/kg，共5 d。

1.5 神经行为学评价

术后7 d，采用5分制神经分级评估神经缺损。0，无明显神经缺损；1，右侧前肢弯曲；2，当尾巴被牵拉时，右前肢肌力下降；3，当尾巴被牵拉时，向右转圈；4，自发向右转圈[7]。

1.6 TTC染色

行为学评分后，各组取5 只大鼠，迅速断头取脑，-20 ℃冰箱冷冻约15 min，冠状切片，厚1.5 mm。脑片迅速放入1% TTC 磷酸盐缓冲液中，37 ℃水浴避光孵育10 min。计算脑梗死体积[8]。

1.7 逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)

各组取5 只大鼠，心脏灌注处死。取大脑缺血半影区部分组织，RNA 提取试剂盒提取RNA，逆转录试剂盒逆转录生成cDNA。BDNF 特异性引物行RTPCR 扩增。产物电泳，凝胶图像分析系统分析，以假手术组为基础计算相对光密度。

引物序列：上游5'-ATC CAC TGA GCA AAG CCG AAC-3'；下游5'-CAG CCC ATG CAA CCG AAG TA-3'。

1.8 ELISA

大脑缺血半影区部分组织匀浆，离心取上清，按照BDNF ELISA 试剂盒的步骤操作，492 nm 处测光密度，绘制标准曲线，以假手术组为基础计算BDNF 相对浓度。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行分析。数据符合正态分布，以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukeyt检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 神经行为学评分

术后7 d，假手术组神经行为学评分正常，模型组评分增高(P<0.05)；与模型组相比，运动组评分降低(P< 0.05)，综合组评分进一步降低(P< 0.05)。见表1。

表1 各组神经行为学评分比较

2.2 脑梗死体积

假手术组无梗死，模型组有明显局灶性梗死(P<0.05)；与模型组相比，运动组和戊四氮组脑梗死体积均降低(P<0.05)，综合组脑梗死体积进一步降低(P<0.05)。见图1、表2。

2.3 BDNF mRNA及蛋白表达

图1 各组典型TTC染色

与假手术组相比，模型组BDNF mRNA 和蛋白表达均降低(P<0.05)；与模型组相比，运动组和戊四氮组BDNF 表达增高(P<0.05)，综合组BDNF 表达进一步升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组检测指标比较

3 讨论

以GABA 为靶点的运动或药物治疗对脑卒中运动功能恢复有益[9]。BDNF 能增强突触可塑性，如长时程增强，可能是脑卒中后恢复的潜在生物标志物[10-11]。脑卒中后学习记忆改善不仅伴有海马BDNF 上调，也伴随胶质细胞源性神经营养因子上调[12-13]。GABA 受体拮抗剂可增加BDNF 表达[14]。有氧运动可增加动物模型脑区BDNF 表达[15-17]。本研究显示，联合采用跑步运动与低剂量戊四氮，比单独干预更能促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复，可能与上调大鼠缺血半影区BDNF表达水平有关。

Ca2+是众多细胞信号传导的关键调控因子[18]。Ca2+流入神经元触发环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMPresponse element binding protein,CREB)磷酸化，而CREB 是BDNF 转录激活的最重要调节因子之一[19]。戊四氮阻断GABA 活性，并伴随着Ca2+流入和CREB磷酸化[20]。运动可激活皮质神经元，增强CREB 磷酸化[21]。

本研究选择低剂量GABA 受体拮抗剂，以避免可能的副作用，如神经毒性。本研究和以往研究中均未发现低剂量GABA 受体拮抗剂有明显副作用，提示短期小剂量GABA 受体拮抗剂给药的安全性[22]。以GABA 介导的突触抑制为靶点，可为神经药理学和运动诱导神经可塑性提供新的理论依据。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。